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    陰陽共調(diào)湯干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的實驗研究

    2020-11-04 02:04:00陳藝緣張茂云梁健峰白瀟嫻王柏淇劉宏巖郭軍鵬錢婷婷劉巖松
    吉林中醫(yī)藥 2020年10期
    關鍵詞:湯劑骨量小梁

    陳藝緣,張茂云,孫 睿,梁健峰,白瀟嫻,王柏淇,劉宏巖,郭軍鵬,錢婷婷,劉巖松

    (長春中醫(yī)藥大學,長春 130117)

    骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病,表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構損傷和骨量減少,骨脆性增加導致骨折易發(fā),尤其以絕經(jīng)后的女性和老年男性最為多見[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMPO)是由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退引起雌激素水平分泌降低的一種代謝性疾病[2],致使患者易骨折,嚴重可致殘甚至致死。目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要以抑制骨吸收藥物、促進骨形成藥物、骨礦物藥物為主,如雌激素、鈣劑、甲狀旁腺素等。這些藥物在臨床上有著良好的效果,但此類藥物大多需要長時間服用,這種服藥方式會帶來很多不良反應,如雌激素的長時間應用會提高罹患子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生概率[3],除此外還有增加異常子宮出血、卵巢癌等風險[4]。為降低雌激素等治療藥物帶來的不良反應,同時有效干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,近年來中醫(yī)學界對于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的研究頗多,如何更好地防止絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥成為研究的熱點。

    中醫(yī)學中并沒有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥這一病名,根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其劃歸為“骨痿”“骨枯”“腰痛”等范疇[5]。中醫(yī)認為,本病發(fā)病緩慢,《素問·上古天真論篇第一》:“七七,任脈虛太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子。”絕經(jīng)后天癸竭,以致腎精虧虛,日久髓海空虛是該病之病機。治療大多以“滋陰、補腎、健脾”[6]立著。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后婦女雖以陰虛多見,但臨床多以陰陽兩虛之證候同時出現(xiàn),當以“陰陽共調(diào)”論治。本實驗通過去卵巢術建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型,對比陰陽共調(diào)湯、雌激素、金匱腎氣丸湯劑、六味地黃湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的影響,進行該項動物實驗,以期提供動物實驗數(shù)據(jù),為以后研究提供新依據(jù),為臨床提供新思路。

    1 材料

    1.1 實驗藥物 陰陽共調(diào)湯由熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,茯苓9 g,牡丹皮12 g,葛根12 g,龜板9 g,女貞子12 g,淫羊藿12 g,巴戟天12 g 組成;金匱腎氣丸湯由生地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,茯苓9 g,牡丹皮9 g,桂枝3 g,炮附子3 g組成;六味地黃湯由熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,牡丹皮9 g,茯苓9 g 組成。所有藥物均來自于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房,3 種中藥劑根據(jù)小鼠與人體質(zhì)量1:0.035 比例配比,煎煮時予8 倍水、6 倍水6 次濃縮至30 mL。對照組予補佳樂1 mg 配比溶液。

    1.2 實驗動物 3 月齡SD 雌性小鼠60 只,體質(zhì)量(20±7.7)g。所有小鼠均購于遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號:SCXK(遼)2015-0001,常規(guī)飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學動物實驗室。

    1.3 實驗儀器 蘇木素液,伊紅染色液,梯度濃度乙醇,二甲苯,多聚甲醛,青霉素,羧甲基纖維素鈉,超純水等。石蠟包埋機(HIS-TOCENTRE),石蠟切片機(FINESSE),HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),奧林巴斯BX40顯微鏡,小動物骨強度儀。

    2 方法

    2.1 造模 除假手術組、模型組外,其余各組小鼠以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,行雙側(cè)卵巢切除術。卵巢切除術:1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,將小鼠仰臥于手術臺上,四肢固定,腹部正中偏下處備皮,絡合碘消毒,切開皮膚,于腹白線依次切開肌肉,剪開腹膜進入腹腔,可見乳白色組織。輕輕將之拉出腹腔,即可見被包裹的粉紅色高粱米大小“桑葚樣”卵巢,分離后鉗夾、結(jié)扎,剪去卵巢,檢查有無滲血,分層縫合皮膚,絡合碘切口消毒。待麻醉蘇醒。小鼠術后均口服青霉素混懸液(2 萬U/mL)抗感染,連續(xù)3 d。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水攝食,并注意觀察小鼠的情況。

    2.2 劑量及灌胃 在小鼠接受造模處理后第31 天,進行藥物干預。陰陽共調(diào)湯組、金匱腎氣丸湯劑組、六味地黃湯組分別予對應藥劑0.3 mL 灌胃;對照組給予補佳樂混懸液0.3 mL;假手術組、模型組口服等體積的超純水。每日1 次,連續(xù)給藥90 d。

    2.3 取材 第91 天采取斷頭法處死小鼠,處死前一晚斷糧供水,在無菌操作下剝離子宮,稱其重量,剪斷雙側(cè)脛骨、股骨,分離肌肉,測量骨強度值,脛骨、股骨脫鈣2 周處理,切片染色以觀察骨小梁、干骺端。

    2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以均值±標準差(x±s)表達,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;技術資料采用卡方檢驗。

    3 結(jié)果

    3.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 分別測定小鼠術后30、60、90 d(處死前)的體質(zhì)量變化,如表1。術后30天與模型組相比,各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異;術后60 天,與模型組相比,對照組體質(zhì)量增高、金匱腎氣丸湯劑組體質(zhì)量降低,均有顯著差異;術后90 天(處死前),與模型組相比較,陰陽共調(diào)湯劑組與六味地黃湯劑組體質(zhì)量降低,有顯著差異,與對照組相比較,陰陽共調(diào)湯劑組沒有顯著差異。

    表1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 g

    3.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量 分別測定小鼠處死后的子宮重量,如表2。與模型組相比較,對照組與陰陽共調(diào)湯劑組子宮重量增高,有顯著差異;與對照組相比較,陰陽共調(diào)湯劑組無顯著差異。

    表2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量

    3.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度值 取右側(cè)股骨,放置于小動物骨骼強度測定儀上,根據(jù)骨壓碎最大荷載壓力,測定骨骼強度,如表3。

    表3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度值 kg

    3.4 HE 染色小鼠股骨、脛骨冠狀面光鏡圖 分別在4倍鏡、10 倍鏡下觀察骨小梁與干骺端,如圖4、5、6、7。從圖可看出,在4 倍鏡、10 倍鏡下,可以看出,假手術組骨細胞內(nèi)含量豐富,干骺端骨量正常分布,骨小梁排列規(guī)律,脛骨、股骨細胞中無空洞現(xiàn)象,結(jié)構緊密,密度正常。模型組的脛骨和股骨細胞內(nèi)可見多處空洞、骨小梁斷裂、干骺端骨量流失且分布不均勻,骨組織明顯減少,結(jié)構疏松,證明雙側(cè)卵巢切除術可以模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一模型。與模型組相比,陰陽共調(diào)湯劑組的股骨與脛骨的骨小梁之間聯(lián)系更為緊密,排列更有規(guī)律,而模型組骨小梁稀疏纖細,有斷裂、分層;與模型組相比較,干骺端骨量明顯增多。

    4 討論

    圖4 4 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

    圖5 10 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

    圖6 4 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

    圖7 10 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

    中醫(yī)認為,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥由多種病機所致,以腎精虧虛為本,同時與肝脾兩臟有關[7]。“腎主骨,生髓?!惫撬璧某溆蕾囉谀I精的滋養(yǎng),從而使骨骼強健有力[8]。李建國認為,女子以肝為先天,女性的特殊生理、病理都與肝的關系極為密切,女性的生理特點決定了其易于引起肝血虧虛之證,導致肝藏血及疏泄功能失職,引發(fā)陰虛血虧,不能濡養(yǎng)筋骨[9];絕經(jīng)后婦女脾氣虧虛,氣血生化無源,無以填充骨髓,則骨枯髓減,四肢廢痿[10]。但筆者在臨床中發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥陰陽兩虛者甚多。“天癸至,月事以時下;天癸竭,地道不通”,彭勛潛認為女子來潮、絕經(jīng)都與天癸有著密不可分的關系,天癸竭則月經(jīng)竭,進而發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[11]。“天癸竭”主要表現(xiàn)為腎陰虛、腎陽虛或陰陽俱虛等臨床表現(xiàn)[12]。周艷認為,陰陽失衡則諸證峰起[13]。陽存于陰,陰存于陽,“孤陰不生,獨陽不長”,陰陽互根互用,雙方具有互相滋生、促進的作用,同時也會“陽損及陰,陰損及陽”,故而絕經(jīng)后婦女易于出現(xiàn)陰陽兩虛之證,在治療上施以“陰陽共調(diào)”之法,以期使陰陽復交,正氣盛則病自去[14]。

    本實驗采用的去卵巢骨質(zhì)疏松模型是目前最常用的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型[15]。該模型采用手術切除小鼠雙側(cè)卵巢的方法后,其骨代謝活躍,骨量明顯丟失;雌激素水平下降,骨密度值降低,較好的模擬了女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的雌激素水平下降,骨密度值下降,骨強度值下降,骨量丟失加速,鈣、磷等礦物質(zhì)代謝紊亂,破壞了骨形成與骨吸收間的骨代謝平衡,破骨細胞吸收的骨量大于成骨細胞形成的骨量,導致凈骨量丟失的特點[16]。

    目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雌激素補充劑、雷洛昔芬[17]、降鈣素[18]等,并且有相關研究表明維生素D 可以調(diào)節(jié)鈣磷及骨代謝[19]。

    本實驗探究陰陽共調(diào)湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度、骨小梁、干骺端等指標的影響。病理切片提示陰陽共調(diào)湯劑組與對照組干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠有良好的效果,可以明顯改善骨質(zhì)疏松的病理形態(tài),增加骨小梁面積和厚度、增加干骺端的骨量;骨強度提示陰陽共調(diào)湯劑組與對照組能夠顯著提升小鼠的股骨強度,提高荷載能力。陰陽共調(diào)湯劑組與對照組各項指標并無顯著差異,可以認為,陰陽共調(diào)湯與雌激素效力相當。相較于雌激素的使用,陰陽共調(diào)湯可以降低致癌或靜脈血栓[20]等不良反應,更為安全、健康。研究結(jié)果可以為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的臨床提供新的理論依據(jù)及實驗基礎。

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