保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 通路及凋亡的作用研究

崔方強(qiáng)，王悅芬，孟 元，蔡 朕，江心燦，趙文景*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069）

糖尿病腎?。―N）發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病十分重要的原因[1-2]。但是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前并未完全闡明。因此糖尿病腎病缺乏針對(duì)性并且有效的臨床防治措施。多項(xiàng)研究均已證實(shí)，糖尿病腎病中足細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，而足細(xì)胞凋亡在DN 的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3-5]。高糖刺激會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞p38 信號(hào)通路激活，進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑，最終引起caspase-3蛋白激活[6-7]。Caspase-3 蛋白激活直接介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及蛋白尿的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，抑制足細(xì)胞p38 通路激活、減輕足細(xì)胞凋亡，可以有效的延緩DN 疾病的進(jìn)展[8-9]。保腎通絡(luò)方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方，被廣泛應(yīng)用于DN 的臨床防治。此外臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，保腎通絡(luò)方臨床防治DN 療效確切[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察了保腎通絡(luò)方對(duì)于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 通路及足細(xì)胞凋亡的影響，闡明其防治DN 的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8 周齡雄性SD 大鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用條件永生小鼠足細(xì)胞系，購(gòu)于北納生物科技有限公司，批號(hào)：BNCC337685。CCK-8 試劑盒（碧云天生物，C40042），Hochest33258染料（Solarbio，C0021-1ml），DMEM低糖培養(yǎng)基（Genview，GD3114-500ml），葡萄糖（Sigma，SLBC6575V），甘露醇（Sigma，WXBC2419V），胎牛血清（Sciencell，17985），P38 抗體（abcam，ab121828），P-p38 抗體（abcam，ab47363），Caspase-3 抗體（abcam，ab13847），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（凱基生物，KGAA25），保腎通絡(luò)方顆粒劑，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備，每1 g 顆粒劑含4.01 g 生藥，臨床成人用量為每日1.91 g（生藥）/kg。酶標(biāo)儀（北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司，ZS-3），電泳儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DG-300C) ; 迷你雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN) ; 迷你轉(zhuǎn)印電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-40D)，凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（FUSION FX6 XT,Vilber 公司），離心機(jī)(Sigma，3K18)；倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED，Leica，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備 20 只8 周齡雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白血清組、保腎通絡(luò)方低劑量組、保腎通絡(luò)方中劑量組及保腎通絡(luò)方高劑量組，每組5 只。將保腎通絡(luò)方分別配制成濃度為0.5、1、2 g/mL 的低、中、高劑量的灌胃劑。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組分別予相應(yīng)的灌胃劑灌胃。各組大鼠每天灌胃2 次，每次灌胃2 mL，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后，待血藥濃度穩(wěn)定后麻醉大鼠，1%戊巴比妥鈉按照40 mg/kg 劑量麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。將不同組別血清56 ℃水浴30 min，無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，－80 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥 條件永生小鼠足細(xì)胞系移入25 cm2培養(yǎng)瓶，并加入含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基4～5 mL。將足細(xì)胞放入37 ℃、95%空氣和 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖到80%融合時(shí)，進(jìn)行無(wú)血清處理。然后足細(xì)胞分為不同組別：正常對(duì)照組（NC）（低糖培養(yǎng)基加甘露醇加空白血清），模型組（HG）（含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基加空白血清），保腎通絡(luò)方含藥血清低（BSF-L）、中（BSF-M）、高（BSF-H）劑量組（含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基加低、中、高劑量保腎通絡(luò)方含藥血清）。不同組別足細(xì)胞進(jìn)行不同的干預(yù)措施，干預(yù)時(shí)間為24 h。然后進(jìn)行細(xì)胞收集或細(xì)胞固定，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8 檢測(cè) 將重懸的小鼠足細(xì)胞種植于96 孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)目一致且不少于10 000 個(gè)細(xì)胞。將96 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，給予不同的干預(yù)措施。干預(yù)24 h 后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h。然后將96 孔板放置在酶標(biāo)儀上，在450 nm 條件下測(cè)定各孔OD 值，并根據(jù)OD 值測(cè)定細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100%。

1.2.4 Hochest33258 染色 將消毒好的玻璃片放入12孔板，將足細(xì)胞懸液滴加至玻璃片上，加入DMEM 完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁并狀態(tài)良好后給予不同干預(yù)措施，干預(yù)24 h 后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%Triton X-100 室溫透膜20 min，然后用配置好的Hochest33258 染料染色30 min，甘油封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細(xì)胞凋亡情況。每組隨機(jī)選取15 個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光 將消毒好的玻璃片放入12孔板，將足細(xì)胞懸液滴加至玻璃片上，加入DMEM 完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁并狀態(tài)良好后給予不同干預(yù)措施，干預(yù)24 h 后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%Triton X-100 室溫透膜20 min，山羊血清封閉30 min。滴加稀釋好的一抗至玻璃片上，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗后，二抗室溫孵育2 h，DAPI 染核5 min，甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察蛋白分別及表達(dá)情況。每組隨機(jī)選取15 個(gè)視野，計(jì)算熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 Western blot 將裂解液加入收集的足細(xì)胞中，進(jìn)行組織裂解，離心后取上清，完成蛋白提取。然后用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將等量的蛋白提取液加入孔槽中，利用10%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，然后滴加稀釋號(hào)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，ECL 試劑暗室內(nèi)膠片曝光，掃描膠片，用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶。

1.2.7 RT-PCR 將Trizol 加入收集好的足細(xì)胞中，反應(yīng)5 min 后加入氯仿，5～10 min 后離心提取最上層液體，然后向最上層液體依次加入預(yù)冷異丙醇、75%DEPC 乙醇，最后加入DEPC 處理過(guò)的水溶解沉淀，完成足細(xì)胞中的總RNA 的提取。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的mRNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增及熒光定量，采用 2－△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞活力影響 CCK-8 法檢測(cè)不同組別足細(xì)胞活力。與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激可以顯著降低足細(xì)胞活力，而保腎通絡(luò)方含藥血清可以升高足細(xì)胞活力。見(jiàn)圖1。

圖1 不同組別足細(xì)胞活力比較

2.2 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞p38 及P-p38 蛋白表達(dá)影響 WB 檢測(cè)不同組別足細(xì)胞p38 及P-p38 蛋白表達(dá)。p38 蛋白表達(dá)水平在不同組別之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與高糖組相比，保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激可以顯著激活足細(xì)胞p38 信號(hào)通路，而保腎通絡(luò)方含藥血清可以抑制高糖引起的p38 信號(hào)通路激活。見(jiàn)圖2。

圖2 不同組別足細(xì)胞P-p38 及p38 蛋白表達(dá)比較

2.3 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞caspase-3蛋白及mRNA 表達(dá)影響 免疫熒光及RT-PCR 檢測(cè)不同組別足細(xì)胞caspase-3 蛋白和mRNA 表達(dá)。研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞caspase-3蛋白及mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），與高糖組相比，保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激可以顯著上調(diào)足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA表達(dá)，而保腎通絡(luò)方含藥血清可以下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同組別足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)比較

2.4 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞凋亡的影響 Hochest33258 染色檢測(cè)不同組別足細(xì)胞的凋亡情況。與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激可以引起足細(xì)胞凋亡，而保腎通絡(luò)方含藥血清可以減輕高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖4。

圖4 不同組別足細(xì)胞凋亡數(shù)目比較

3 討論

DN 是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致ESRD 的主要原因[1-2]。DN 目前的治療措施有限，并且缺少針對(duì)DN 發(fā)病機(jī)制的有效治療措施。因此盡管已經(jīng)采取了早期積極的臨床干預(yù)措施，我們并未有效的延緩DN 疾病的進(jìn)展。多項(xiàng)研究均已證實(shí)，足細(xì)胞凋亡是DN 疾病進(jìn)展的重要病理機(jī)制[3-5]。腎小球?yàn)V過(guò)膜由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜及足細(xì)胞的足突三層結(jié)構(gòu)組成，其中足細(xì)胞足突是腎小球?yàn)V過(guò)膜最為重要的組成部分。足細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致粘附在基底膜上的足突結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生及疾病的進(jìn)展[11-13]。此外足細(xì)胞是一種終末分化期細(xì)胞，失去了再生增殖的能力，因此足細(xì)胞凋亡引起的腎小球?yàn)V過(guò)膜的破壞無(wú)法得到再生修復(fù)。P38 信號(hào)通路是介導(dǎo)DN 足細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。在DN 中，高糖刺激會(huì)引起足細(xì)胞p38 信號(hào)通路顯著激活，導(dǎo)致P-p38 蛋白表達(dá)上調(diào)。P38 通路激活后會(huì)引起促凋亡蛋白Bax 表達(dá)上調(diào)，抑制凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引起caspase-3 激活，最終介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制足細(xì)胞p38 通路激活，減輕足細(xì)胞凋亡能夠有效的延緩DN 疾病進(jìn)展，可能成為DN 防治新的治療靶點(diǎn)[16-17]。

中醫(yī)藥并沒(méi)有DN 的疾病名稱，從臨床癥狀上看應(yīng)屬于“水腫”“尿濁”“關(guān)格”的疾病范疇。針對(duì)DN 的中醫(yī)病因病機(jī)，不同的醫(yī)家具有不同的認(rèn)識(shí)，形成不同的理論學(xué)說(shuō)如微型癥瘕學(xué)說(shuō)[18]、毒損腎絡(luò)學(xué)說(shuō)[19]。全國(guó)名老中醫(yī)、首都國(guó)醫(yī)名師張炳厚教授根據(jù)五十多年臨床經(jīng)驗(yàn)，提出“腎氣精兩虛，腎失封藏，腎絡(luò)閉阻”是DN 發(fā)病的核心病機(jī)。消渴初期多為陰虛燥熱，繼而出現(xiàn)氣血凝滯，絡(luò)脈閉阻，日久耗傷腎之氣精，導(dǎo)致腎失封藏，精微下泄。因此張炳厚教授以補(bǔ)腎通絡(luò)為DN 的治則，并取得很好的臨床療效。保腎通絡(luò)方就是補(bǔ)腎通絡(luò)的代表方藥，其是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方，被廣泛應(yīng)用于DN 的臨床防治。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，保腎通絡(luò)方具有降低蛋白尿、改善腎功能的作用[10]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，保腎通絡(luò)方能夠改善KK-Ay 小鼠腎臟病理改變，并且能夠上調(diào)KK-Ay 小鼠足細(xì)胞nephrin 蛋白表達(dá)，下調(diào)desmin 蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕足細(xì)胞損傷[20]。但是保腎通絡(luò)方減輕足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制目前并不清楚。

本實(shí)驗(yàn)首先觀察了保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞活力及足細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖刺激可以引起足細(xì)胞活力降低，導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡；而保腎通絡(luò)方含藥血清可以升高高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞活力，并能減輕足細(xì)胞凋亡。鑒于p38 信號(hào)通路在DN 足細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 蛋白及P-p38蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，保腎通絡(luò)方含藥血清能夠下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá)，抑制p38 通路激活。本實(shí)驗(yàn)又觀察了不同組別足細(xì)胞p38通路介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，保腎通絡(luò)方含藥血清能夠下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞caspase-3 蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，保腎通絡(luò)方含藥血清能夠抑制高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 信號(hào)通路激活，減輕足細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為保腎通絡(luò)方臨床防治DN 提供了科學(xué)依據(jù)，但是至于其減輕DN 足細(xì)胞損傷的其他分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。