枸杞酒多糖的提取、成分測定及其對酒精性肝病的影響研究

趙嘉慶，史春麗，王立英，何 斌，趙 巍，王 浩

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750004；3.寧夏森淼枸杞科技開發(fā)有限公司，寧夏 銀川 750000）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由持續(xù)過量飲酒引起的一種慢性、廣譜的肝臟損傷，在全世界酗酒人群中排在發(fā)病率和死亡率的主要原因之列[1]。ALD包括肝損傷的組織學(xué)范圍，從單純性脂肪變性到以炎癥為特征的肝炎，并有可能進展為纖維化和肝硬化。肝臟慢性炎癥在慢性飲酒者中的發(fā)病率約為10%～35%，在ALD的可逆病理過程中起重要作用，可導(dǎo)致超過1/3的發(fā)病率和死亡率[2-4]。當(dāng)肝臟受到損傷時，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）大量釋放到外周血中，其含量異常增高，肝臟組織中出現(xiàn)細(xì)胞壞死和及相關(guān)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而提示肝臟病變[5]，為減少酒精性肝病對人體造成的損傷，大量的研究者進行酒精肝的緩解與保護方面的研究，相關(guān)文獻報道顯示，琴葉榕[6]、草果，菱角殼水提混合物[7]、醋酸菊粉[8]等粗提物對酒精肝均具有一定的保護作用。

枸杞多糖具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗炎和促進生育功能[9-10]外，對酒精肝的作用還不清楚，少有研究關(guān)于來源于枸杞酒類的多糖對酒精肝的作用。該研究主要以枸杞酒為研究對象，經(jīng)過多重工藝進行加工提純，制成香醇可口的養(yǎng)生保健品，其主要為枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）。本研究通過建立經(jīng)典的酒精肝病小鼠模型，并探究寧夏特色枸杞酒產(chǎn)品中枸杞多糖的主要成分，并驗證對酒精肝的保護作用，這有助于枸杞酒的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本信息

枸杞酒（酒精度12%vol）及枸杞酒中提取的枸杞多糖：寧夏銀川森淼科技有限公司。

1.1.2 實驗動物與飼料

選用6～8周齡的60只雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為28～30 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機分為4組，每組15只，分別為對照組、模型組、對照＋LBP組、模型＋LBP組。飼養(yǎng)于溫度在20～26 ℃，相對濕度在45%～75%的SPF動物房內(nèi)。

飼料：模型組飼喂能量組成為蛋白質(zhì)18%、碳水化合物19%、脂肪35%、乙醇28%的改良酒精玉米油液體日糧，對照組飼喂等熱量麥芽糖糊精的改良玉米油液體日糧作為對照，均購買于中國南通營養(yǎng)動物飼料高科技有限公司。

1.1.3 試劑

硝酸、鹽酸、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（分析純）、多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液；丙酮溶液70%、雷氏鹽3%；血清內(nèi)毒素檢測試劑盒（鱟試劑）：廈門生物多科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10細(xì)胞因子檢測試劑盒：廈門生物多科技有限公司；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-NS-300中試水提醇沉設(shè)備：上海順儀實驗設(shè)備有限公司；AU400全自動生化分析儀：710-ES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀：美國瓦里安公司；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；日本奧林巴斯公司；C6流式細(xì)胞分析儀：美國BD公司；Z326K臺式冷凍離心機：德國Hermle公司；GYXH-70制冰機：廈門國儀科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞酒多糖提取及制備

以釀制的酒精度為12%vol枸杞酒為原料，每次1000mL，進行旋蒸濃縮，全部濃縮完成后合并濃縮液，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇調(diào)至乙醇終體積分?jǐn)?shù)80%后，沉淀過夜，傾出上清液后，冷凍干燥即得。

1.3.2 枸杞酒中枸杞多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥質(zhì)量恒定的分析純無水葡萄糖0.1 g，加水溶解并定容至1 000 mL。準(zhǔn)確吸取溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL，分別置于具塞試管中，各加水使體積為2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫；另取水2 mL加6%苯酚溶液和濃硫酸，同上操作，作為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取0.01 mL枸杞酒樣品，再分別加入超純水1.99 mL，混勻。

1.3.3 枸杞酒多糖中礦質(zhì)元素含量檢測

稱取制備好的枸杞酒多糖0.1 g置于50 mL消解管中，加入10 mL硝酸，利用石墨消解爐加熱至180 ℃消解，當(dāng)溶液消解至無色透明狀后，繼續(xù)趕酸，剩余1～2 mL停止消解，轉(zhuǎn)移至10 mL樣品管中，使用超純水定容，上機檢測[11]。

1.3.4 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定

稱取制備好的枸杞酒多糖0.1 g，置于厭氧管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的鹽酸溶液，置于110 ℃烘箱中，水解反應(yīng)24 h，水解結(jié)束后，放至室溫，過濾，吸取0.5 mL濾液置于試管濃縮儀中，濃縮蒸發(fā)至干，加入2 mL樣本稀釋液，震蕩混勻，用0.22 μm水性濾膜過濾后，上機檢測。

1.3.5 實驗動物處理方法

根據(jù)現(xiàn)有文獻報道[12]的方法，進行酒精肝模型的制備。一種簡單的酒精性肝脂肪變性小鼠模型是通過長期酒精喂養(yǎng)加一次大量酒精攝入后誘導(dǎo)而成[13]。模型+LBP與對照+LBP兩組每只鼠每日分別進行枸杞酒多糖150 mg/kg長達6周的灌胃，模型與對照組小鼠灌服等量的生理鹽水后，所有小鼠口服對照液體飼料一周，然后給予含有乙醇的改良液體飼料（模型組）或等熱量麥芽糖糊精作為對照（對照組），為期10 d，第11天，單次灌胃31.5%乙醇（5 g/kg）或等熱量麥芽糖糊精溶液。對照組和對照+LBP組分別為模型組和模型+LBP組的配對喂養(yǎng)對照。根據(jù)制造商的說明，每天都有新鮮的粉末制成流質(zhì)日糧，監(jiān)測并計算飲酒小鼠的攝食量和平均每天每只小鼠的攝食量。計算出的體積被用來調(diào)整給予配對喂養(yǎng)的小鼠的對照液體飲食量，以便酒精喂養(yǎng)的小鼠和配對喂養(yǎng)的小鼠攝入等量的食物。第12天，安樂處死小鼠，觀察相關(guān)指標(biāo)。

1.3.6 生化指標(biāo)檢測

取小鼠外周血于1.5 mL離心管中，2 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離出血清。寧夏醫(yī)科大學(xué)科技中心醫(yī)學(xué)分析檢測中心檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的含量。

1.3.7 血清內(nèi)毒素含量檢測

血清內(nèi)毒素的含量采用廈門科技有限公司血清內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測，操作步驟詳見說明書。

1.3.8 脾臟與血清酶聯(lián)免疫吸附實驗

取0.5 g肝組織勻清于1.5 mL冰冷50 mol/L Tris緩沖液（pH 7.2，Tris含1%Triton-X100和0.1%蛋白酶抑制劑）中，冰上振蕩90 min。取勻清，3 000 g離心15 min。收集上清液測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清和肝組織上清液中各細(xì)胞因子水平，按操作說明書進行。

1.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組實驗數(shù)據(jù)用表示，兩組間比較用兩樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞酒多糖的提取

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=36.47x+0.025 3，相關(guān)系數(shù)為R=0.998 6。以枸杞酒為原材料，提取枸杞多糖其多糖質(zhì)量濃度為1.2 g/L。

2.2 枸杞酒多糖成分的測定

2.2.1 枸杞酒多糖中礦質(zhì)元素含量測定

對枸杞酒多糖中礦物質(zhì)元素含量的檢測，含量測定結(jié)果見表1。由表1可知，枸杞酒多糖中礦物質(zhì)元素種類和含量較為豐富，其中常量元素Ca、P、Mg、K、Na的含量較高，分別為0.09%，0.68%，0.27%，3.92%，0.51%。這些常量元素是維持人機體代謝的重要物質(zhì)，缺少任何一種都會使人體代謝出現(xiàn)失調(diào)[14]。枸杞多糖中含量前三的微量元素有Fe、Zn、Cu，其含量分別為0.007 8%，0.005 3%，0.002 5%。微量元素能與氨基酸、蛋白質(zhì)或其它有機結(jié)合形成各種酶、激素、核酸、維生素等具有生物活性和催化生物反應(yīng)的作用。這些礦物質(zhì)元素含量明顯高于趙麗莉等[15]通過微波密閉消解法測定寧夏枸杞中礦物元素中的元素含量，說明枸杞酒多糖中含有較高的礦物質(zhì)元素，這可能對人體的代謝具有一定的促進作用。

表1 枸杞葉多糖中礦質(zhì)元素含量檢測結(jié)果Table 1 Determination results of mineral elements in polysaccharides of Lycium barbarum wine

2.2.2 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定

氨基酸對人體的代謝組成發(fā)揮著重要作用。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，能夠維持人體的正常代謝，是體內(nèi)的酶、激素、抗體的重要組成成分，具有延年益壽，增加免疫力的功效。而枸杞多糖能夠增加機體免疫力，這與其中含有多種氨基酸是分不開的。對枸杞酒多糖中氨基酸含量進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，枸杞酒多糖中共檢測到17種氨基酸，其中以天冬氨酸（ASP）、谷氨酸（GLU）、脯氨酸（PRO）的含量較多，分別為7.25%、4.96%、3.56%，其次為絲氨酸（SER）、丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG），含量分別為1.87%、1.74%、1.24%。蘇氨酸（THR）、組氨酸（HIS）、賴氨酸（LYS）、纈氨酸（VAL）、亮氨酸（LEU）含量分別為0.86%，0.34%，0.33%，0.30%，0.30%。

表2 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of amino acids in polysaccharides of Lycium barbarum wine

2.3 枸杞酒多糖對酒精性肝病的影響

2.3.1 小鼠血清中ALT、AST及LPS水平

慢性飲酒后血清丙氯酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平異常增高，提示肝臟受到損傷[16-18]。不同處理組對小鼠血清中ALT以及AST水平的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，模型組血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.001），可判定酒精肝造模成功。模型+LBP組小鼠血清ALT、AST明顯降低（P＜0.001），具有統(tǒng)計學(xué)差異。提示LBP得干預(yù)可減輕慢性酒精喂養(yǎng)所致的肝損傷。就相關(guān)文獻報道，LBP也可通過降低其他炎癥性疾病的ALT和AST水平來減輕肝臟損傷的能力[19-20]。

圖1 不同處理組對小鼠血清中血清谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平的影響Fig.1 Effects of different treatment groups on the level of alanine amino transferase and aspartate amino transferase in mice plasma

圖2 不同處理組對小鼠血清中脂多糖水平的影響Fig.2 Effects of different treatment groups on the level of lipopolysaccharide in mice plasma

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是ALD肝臟炎癥的觸發(fā)因子，通過門靜脈移位到肝臟，與抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）的TLR-4結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致慢性肝炎[21]。不同處理組對小鼠血清中LPS水平的影響結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，與模型組相比，模型+LBP組血清內(nèi)毒素水平顯著降低（P＜0.000 1），但仍高于對照組和對照+LBP組，說明膳食LBP具有降低血液循環(huán)內(nèi)毒素血癥的作用，降低ALD大鼠腸道通透性，減少LPS從腸道向肝臟的移位，減少ALD的系統(tǒng)循環(huán)，從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。這種減弱可能與腸道天然免疫系統(tǒng)有關(guān)，其潛在機制需要進一步研究[22]。

2.3.2 小鼠血清及肝臟中細(xì)胞因子水平。

圖3 不同處理組對小鼠血清和肝臟細(xì)胞因子水平的影響Fig.3 Effects of different treatment groups on the levels of cytokines in plasma and liver of mice

庫普弗細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是ALD引起炎癥的主要細(xì)胞，其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6），導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死，從而導(dǎo)致肝損傷[23-24]。不同處理組對小鼠血清和肝臟細(xì)胞因子水平的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，慢性酒精攝入后，空白組血清和肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α較上述細(xì)胞因子顯著升高（P＜0.05），然而經(jīng)過LBP干預(yù)后的模型鼠降低乙醇引起的血清和肝臟IL-1β異常升高（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)差異。同樣，模型+LBP組血清和肝臟IL-6和TNF-α水平也明顯低于這兩種細(xì)胞因子（P＜0.000 1）。模型組與模型+LBP組血清和肝臟IL-10水平無顯著性差異（P＞0.05）。表明經(jīng)LBP治療后，循環(huán)和肝臟炎癥明顯減輕，提示LBP對ALD的保護作用可能與其抗炎作用有關(guān)。

3 結(jié)論

從枸杞酒中提取出多糖，并對其成分進行了測定，發(fā)現(xiàn)了大量的氨基酸及礦物質(zhì)元素，從而進一步證實了枸杞多糖是枸杞酒發(fā)揮養(yǎng)生保健作用的重要因素，并且長期飲食枸杞多糖的酒精肝小鼠，血清中ALT、AST及LPS含量較酒精肝模型組明顯降低，炎癥因子也顯著下降?？梢奓BP的干預(yù)可緩解酒精性肝損傷，提示在日常飲酒的過程中，含有枸杞多糖的枸杞酒可以在一定程度上減輕酒精對人體造成的傷害，這對寧夏枸杞酒的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用價值。但是來源于枸杞酒中的枸杞多糖具體的酸堿度及活性成分分析及對酒精肝發(fā)揮作用的具體機制還需進一步研究。