高產乙酸乙酯酵母菌篩選及固態(tài)發(fā)酵應用研究

劉小改，馬美榮，周林艷，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

乙酸乙酯是清香型白酒中特征香氣成分，通常表現(xiàn)為水果香、花香和甜香，對增加白酒香氣、醇厚度、提升白酒品質有重要作用[1]。二鍋頭白酒作為清香型白酒代表之一，其中乙酸乙酯的含量是衡量酒質好壞的重要標準之一[2]。清香型白酒釀造過程中，乙酸乙酯主要來自于產酯酵母。產酯酵母又稱生香酵母，是一類能夠代謝生成酯類物質的酵母菌總稱，通常包括漢遜酵母屬（Hansenula）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）等[3-5]。該類酵母能夠在生長繁殖過程利用葡萄糖代謝產生乙醛、乙酸，并在其自身酯化酶的催化作用下合成乙酸乙酯[6]。在我國，應用生香酵母提高白酒質量始于20世紀60年代初期，前沈陽輕院與錦州酒廠就用生香酵母明顯地提高了麩曲白酒的酒質，而真正商品化的生香酵母是于1995年由湖北宜昌安琪酵母基地開始生產的，當生香酵母被制成活性干酵母后，既充分發(fā)揮了增酯作用，又方便了運輸、貯存及使用[7]。史雁飛[8]通過應用酵母細胞固定化技術，增強了產酯酵母生長繁殖能力，提高細胞活性和抗逆性，并達到反復利用的目的，極大地提升了產酯酵母的應用效果。劉桂君等[9]在液態(tài)發(fā)酵生產白酒時用生香酵母與紅曲、釀酒酵母共同發(fā)酵，所獲白酒乙酸乙酯的含量有較大幅度提高，酒的口味和香氣均有改善。宋玉華等[10]在清香酒生產中添加固體產酯酵母入池發(fā)酵，乙酸乙酯含量明顯提高，且酒質甘爽余味長，清香風格明顯。

產酯酵母菌代謝產酯受諸多因素影響，如發(fā)酵培養(yǎng)基、溫度、時間、pH值、供氧情況等。與兼性厭氧的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在無氧條件下繁殖代謝不同，大多數(shù)產酯酵母為需氧菌，必須在有氧條件下生長代謝[11]，且白酒生產中酒醅酸度和發(fā)酵期是極為重要的發(fā)酵條件，直接影響白酒生產的質量和產量，因此研究發(fā)酵酒醅酸度、酒醅中溶氧情況、發(fā)酵時間對產酯酵母代謝的影響，可為產酯酵母在白酒釀造生產中應用提供重要的理論依據(jù)，這對于白酒生產的提質保量是極為必要的。

本研究通過對實驗室保藏的5株酵母菌的乙酸乙酯生產能力進行研究，從中篩選出一株高產乙酸乙酯酵母菌，并對該菌株在白酒釀造過程中的固態(tài)發(fā)酵條件進行研究，考察糧糟比例、酒醅疏松度、發(fā)酵時間3個因素對其發(fā)酵產乙酸乙酯效果的影響，其中，通過調整糧糟比例調節(jié)酒醅入池酸度，通過調整酒醅疏松程度調節(jié)入池酒醅中氧氣含量，確定最佳發(fā)酵條件。進一步在釀造中試車間應用產酯酵母J-4進行發(fā)酵增酯實驗，并以未添加產酯酵母發(fā)酵的酒班為對照，對兩班所產原酒指標進行分析對比，并對酒樣進行感官品評，以驗證和評估該株產酯酵母在大生產中的應用性能及效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5：北京紅星股份有限公司從清香型酒曲中分離并保存；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

玉米粉：市售；白酒蒸餾酒尾、麩曲、高粱粉、酒糟、稻殼：北京紅星股份有限公司釀造車間；酚酞（分析純）：福晨（天津）化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠有限責任公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、異丁醇、乳酸乙酯（純度均≥99.0%）：中國計量科學研究院國家標準物質資源庫；乙酸正戊酯（純度≥99.0%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[12]：8～10 °Bx玉米糖化液，pH 4.0～5.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。玉米糖化液[13]：在糊化鍋內加入原料質量6倍的水，打開蒸汽加熱，同時均勻撒入原料玉米粉，要求玉米粉不得結塊，蒸煮2 h糊化，糊化結束后料液降溫冷卻至60 ℃，加入原料質量20%的麩曲攪拌均勻，保持溫度55～60 ℃，糖化3～4 h，糖化完畢后離心過濾，加水稀釋至8～10°Bx糖度。

酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：酒糟與水按質量比1∶4混合均勻后過濾，在浸出液中加入10%白酒蒸餾酒尾，酒尾酒精度為25%vol，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器及設備

GC-2010 plus氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：日本島津公司；CJ-2DFS凈化工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；JJ6000型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀酒高活性干酵母活化

將安琪釀酒高活性干酵母接種于玉米糖化液，混勻后于38 ℃活化30 min，備用[15]。

1.3.2 產酯酵母種子培養(yǎng)

自保藏斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)產酯酵母接種于裝有種子培養(yǎng)基的試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后按照10%（V/V）的接種量轉接于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量100 mL/500 mL，28 ℃培養(yǎng)24 h[16-17]，作為種子液備用。

1.3.3 高產乙酸乙酯酵母菌的篩選

將酵母種子液按4%（V/V）的接種量轉接于酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天取發(fā)酵液檢測乙酸乙酯含量。

1.3.4 白酒釀造工藝

操作要點：將高粱粉碎成粉狀，酒糟、高粱粉按照不同配比混合均勻，加入稻殼、水，稻殼添加量為高粱粉質量的25%，適當加水調節(jié)醅料水分至55%左右，拌勻后100 ℃蒸料40 min，蒸料完成后物料經攤涼、降溫至30 ℃左右，將高產乙酸乙酯酵母種子液按高粱粉質量的4%接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時按高粱粉質量加入8%麩曲、0.03%活化后的安琪釀酒高活性干酵母，并再次翻拌均勻后入池發(fā)酵。發(fā)酵完成后，將酒醅從發(fā)酵池中取出，裝入甑鍋中蒸餾取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作為丟糟棄用，剩余80%酒糟作為回糟再次配糧后進行發(fā)酵應用。

1.3.5 高產乙酸乙酯酵母固態(tài)發(fā)酵實驗

將醅料拌勻后裝入不銹鋼發(fā)酵桶（滿桶容積0.014 m3）內，以不同力度壓實醅料至與桶沿齊平，測量發(fā)酵桶內所裝醅料質量，以帶硅膠密封圈及排汽管的發(fā)酵桶蓋封口，發(fā)酵桶置于室溫狀態(tài)下，待醅料發(fā)酵不同時間后蒸餾取酒，檢測原酒中乙酸乙酯含量及出酒率?？疾旒Z糟質量比（1.0∶3.5、1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0、1.0∶5.5）、入池酒醅疏松度（不施壓力、輕微壓力、正常壓力、加重壓力）及發(fā)酵時間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對菌株JT-4產乙酸乙酯的影響。

1.3.6 麩曲白酒釀造生產

采用1.3.4發(fā)酵工藝，將醅料拌勻后轉移至水泥發(fā)酵池（滿池容積45 m3）內，以塑料薄膜覆蓋，進行人工踩窖，室溫狀態(tài)下進行發(fā)酵。測定原酒出酒率及理化指標，并進行感官評價。

1.3.7 檢測方法

揮發(fā)性成分的測定：采用氣相色譜法檢測原酒中揮發(fā)性成分的含量。色譜條件參照楊強等[18]的方法，并略作修改：LZP-930石英毛細管色譜柱（50 m×0.32 mm×1.00 μm）柱；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測器，檢測器溫度230 ℃；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，再以20 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；載氣為氮氣（N2）；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1∶30。根據(jù)保留時間定性[19]，采用內標法定量，內標物為乙酸正戊酯（質量濃度0.117 g/L）。

酸度的測定：根據(jù)T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》進行測定[20]。

發(fā)酵醅料質量的測定：稱量空發(fā)酵桶及封蓋質量，向桶中裝入醅料并封蓋后再次稱量總質量，用總質量減去空桶及蓋的質量，即為所裝發(fā)酵醅料質量。

發(fā)酵醅料密度的測定：發(fā)酵醅料密度=發(fā)酵桶所裝發(fā)酵醅料質量/發(fā)酵桶滿桶容積。其中，發(fā)酵桶滿桶容積為0.014 m3。

原料出酒率的測定：原料出酒率=65%vol原酒產量/原料用量×100%[21]。

感官評價：根據(jù)GB/T 33405—2016《白酒感官品評術語》進行品評描述[22]。

2 結果與分析

2.1 高產乙酸乙酯酵母菌的篩選

以未接菌的培養(yǎng)基為空白對照，酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5在酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d、3 d、4 d和5 d后，乙酸乙酯含量見表1。

表1 不同酵母菌株培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量Table 1 Content of ethyl acetate in culture solution of different yeast strains

由表1可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4產乙酸乙酯能力明顯優(yōu)于其他4株酵母，當培養(yǎng)4 d時，菌株J-4培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量達到最高，為1.38 g/L，酵母菌在生成乙酸乙酯的同時也在不斷代謝分解溶液中的乙酸乙酯，隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，菌體衰退，合成乙酸乙酯的能力降低，菌株J-4培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量下降。通過實驗對比可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4具有較強的乙酸乙酯合成能力，故選擇該株酵母菌進行后續(xù)實驗。

2.2 高產乙酸乙酯酵母J-4固態(tài)白酒發(fā)酵實驗

2.2.1 糧糟質量比對酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的影響

應用發(fā)酵桶為發(fā)酵容器，進行初步固態(tài)白酒發(fā)酵實驗。以4.5 kg質量酒醅入發(fā)酵桶，壓平至滿桶高度（正常壓力），加蓋密封后于室溫發(fā)酵6 d后，不同糧糟質量比對酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵入池酒醅酸度、出酒率及原酒中乙酸乙酯產量的影響見表2。

表2 不同糧糟質量比對菌株J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產量的影響Table 2 Effect of different sorghum to vinasse ratio on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表2可知，酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著糧糟質量比減小，即入池酒醅酸度上升，所產原酒中乙酸乙酯含量逐漸升高，出酒率隨之降低，分析原因可能為產酯酵母利用發(fā)酵過程中生成的乙醇合成乙酸乙酯，導致出酒率下降。由此可見，在一定程度上提高酒醅入池酸度有利于酵母代謝生成乙酸乙酯。當高粱粉與酒糟質量比升高至1.0∶5.5時，雖然原酒中乙酸乙酯含量可達1.55 g/L，但出酒率僅為41.5%，損失較大，究其原因，除乙醇轉化為乙酸乙酯造成出酒率下降外，較高的酒醅酸度在一定程度上對其他微生物生長代謝產生抑制作用，使發(fā)酵速度減慢[23-24]，從而導致出酒率降低。

通過數(shù)據(jù)對比可知，應用高產乙酸乙酯酵母菌J-4進行固態(tài)發(fā)酵，當高粱粉與酒糟質量比為1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0，即入池酒醅酸度為0.9～1.3 mmol/10 g時，所產原酒均可同時具有較高的乙酸乙酯含量和較高的出酒率。綜合考慮高乙酸乙酯含量原酒適用性較強及生產中對出酒率的要求，最終確定以高粱粉與酒糟質量比例1.0∶4.5為最佳糧糟質量比。

2.2.2 入池酒醅疏松度對酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的影響

釀酒酵母屬兼性厭氧菌，可在無氧條件下進行生長代謝，而大多數(shù)生香酵母則需在有氧條件下生長代謝[25-26]。王瑞明等[27]研究表明，氧氣對異常漢遜酵母（Hansenula anomala）酯類代謝起著很重要的作用。因此，通過調整發(fā)酵酒醅疏松程度調節(jié)發(fā)酵體系中氧氣含量，考察其對酵母菌J-4發(fā)酵產乙酸乙酯的影響，高粱粉與酒糟質量比為1.0∶4.5，發(fā)酵時間為6 d，發(fā)酵結束后蒸餾取酒，計算出酒率并檢測原酒中乙酸乙酯含量，結果見表3。

表3 不同酒醅疏松度對菌株J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產量的影響Table 3 Effect of different pressure on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表3可知，隨著醅料疏松程度降低，酒醅內氧氣含量減少，原酒中乙酸乙酯含量降低，出酒率逐步升高，酵母菌J-4代謝合成乙酸乙酯需在有氧條件下進行，降低發(fā)酵體系溶氧量對產酯酵母代謝產生影響，但對于無氧條件發(fā)酵產酒精的釀酒酵母來說，酒醅低含氧量有助于其代謝合成酒精。應用酵母菌J-4進行固態(tài)發(fā)酵，當采用正常壓醅及加壓壓醅時，可在保持較高出酒率的基礎上提高原酒中乙酸乙酯含量。由于正常生產中發(fā)酵池體積較大，投糧量較多（一般每池1～4 t投糧），很難實現(xiàn)前兩種醅料狀態(tài)，且低出酒率直接導致經濟損失，因此生產中醅料入池后采用正常踩窖即可。

2.2.3 發(fā)酵時間對酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的影響采用高粱粉與酒糟質量比1.0∶4.5，醅料裝入發(fā)酵桶后以正常壓力壓實，于室溫下分別發(fā)酵不同時間，發(fā)酵結束后蒸餾取酒，考察不同發(fā)酵期對酵母菌J-4發(fā)酵產乙酸乙酯的影響，結果見表4。

表4 不同發(fā)酵時間對酵母J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產量的影響Table 4 Effect of different fermentation time on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表4可知，當酒醅發(fā)酵6～7 d時，主發(fā)酵期基本已經到達終點，無論是釀酒酵母發(fā)酵產酒精量還是產酯酵母代謝合成乙酸乙酯量，均已達到較高水平，繼續(xù)延長發(fā)酵期，出酒率、乙酸乙酯含量增長幅度均有限，當發(fā)酵期延長至10 d時，原酒中乙酸乙酯含量明顯降低，酒醅中乙酸乙酯趨于分解，且延長發(fā)酵周期會降低窖池使用效率，在一定程度上給原酒生產造成經濟損失[28]，因此，確定7 d為原酒發(fā)酵周期。

2.3 高產乙酸乙酯酵母菌J-4的在麩曲白酒釀造生產中的應用

采用1.3.4發(fā)酵工藝，以水泥池為發(fā)酵容器，確定糧糟質量比為1.0∶4.5，發(fā)酵時間7 d，醅料入池后進行正常踩窖，進一步將酵母菌J-4應用于釀造車間規(guī)?；熐拙粕a中，以不添加酵母菌J-4組為對照。發(fā)酵結束后分別計算出酒率并檢測所產原酒理化指標，結果見表5。

表5 原酒出酒率及理化指標Table 5 Liquor yield and physicochemical indicators of base liquor

由表5可知，酵母菌J-4組出酒率（45.3%）略低于對照組出酒率（45.7%），比對照組出酒率降低0.87%；酵母菌J-4組乙酸乙酯含量（1.07 g/L）明顯高于對照組酒樣（0.71 g/L），比對照組酒樣增長50.7%。酵母菌J-4組乳酸乙酯含量低于乙酸乙酯含量，符合清香型白酒風格特點，乙醛、甲醇、正丙醇、異丁醇含量較低，有助于增加酒體風味及協(xié)調性。

分別對兩組原酒酒樣進行感官品評，結果見表6。

表6 原酒感官品評結果Table 6 Results of sensory evaluation of base liquor

由表6可知，在清香型麩曲白酒釀造過程中，通過添加酵母菌J-4，可顯著提升原酒中乙酸乙酯含量，可明顯改善原酒口感，增加酒體綿柔度及豐滿度，提升原酒品質。

3 結論

篩選出一株具有高產乙酸乙酯能力的酵母菌株J-4，乙酸乙酯產量為1.38 g/L，其最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵條件為高粱粉與酒糟質量比1.0∶4.5，發(fā)酵時間7 d，酒醅入池發(fā)酵后，以正常壓力進行壓醅。在此最優(yōu)條件下，所得原酒中乙酸乙酯含量為1.31 g/L，出酒率為46.3%，均達到較高水平。進一步將酵母菌J-4應用于麩曲白酒釀造生產，所產原酒中乙酸乙酯含量可達1.07 g/L，比對照組酒樣增長50.7%；出酒率為45.3%，比對照組酒樣降低0.87%。經品評，所得原酒口感、品質亦得到明顯改善。因此，酵母J-4應用于清香型麩曲白酒釀造中，具有良好的增酯效果。