紫甘薯花青素對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠腸道屏障損傷的修復作用*

朱成雷， 穆晶晶， 徐靜雯， 王琳琳， 周鄭坤， 鄭元林， 陳才法△

（江蘇師范大學 1健康科學學院，2生命科學學院，江蘇徐州221009）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）已經(jīng)發(fā)展成為全球性疾病，其發(fā)病率在新興工業(yè)化國家呈上升趨勢，而在西方發(fā)達國家則一直為高患病率［1］。炎癥性腸病主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，其中潰瘍性結腸炎為其主要形式，其主要臨床特征為彌漫性炎癥，包括直腸黏膜改變，近端結腸長度改變和更嚴重的遠端結腸病變等［2］，其發(fā)病機制目前尚不明確，大多認為是由飲食習慣，環(huán)境，免疫調節(jié)，腸道微生物等多種因素共同作用的結果［3］。有實驗表明，腸上皮屏障功能在潰瘍性結腸炎的發(fā)病中起著重要作用［4-6］，腸道屏障損傷會使黏膜的通透性增加，使腔內環(huán)境中的病原體，毒素和抗原滲透到黏膜組織中，從而誘發(fā)炎癥［7-8］。緊密連接的完整性決定了腸上皮屏障功能［9-10］，在潰瘍性結腸炎患者中，上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達減弱，而在上調了ZO-1、occludin表達后，腸道炎癥癥狀減輕［11-13］。天然產(chǎn)物紫甘薯花青素（purple sweet potato anthacyanin，PSPA）是黃酮類化合物，具有眾多藥用價值，大量文獻報道了其抗氧化，抗腫瘤和降血脂等功效［14-16］。.已有實驗證明原花青素對于腸炎中緊密連接蛋白具有一定的調節(jié)作用［17-18］，但紫甘薯花青素對于腸黏膜屏障的作用尚無相關報道。本研究主要探討紫甘薯花青素對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎小鼠腸上皮緊密蛋白表達的影響，為進一步開發(fā)和研究有關治療方法提供理論基礎。

材料和方法

1 藥物、試劑和儀器

葡聚糖硫酸鈉（相對分子質量36 000～50 000 Mw；MP Biomedicals）；青島花青素干粉（青島鵬遠康華天然產(chǎn)物有限公司；色價E1%1cm=106）；兔抗GAPDH單克隆抗體購自Abways Technology；兔抗ZO-1 多克隆抗體、兔抗 occludin 多克隆抗體、鼠抗 TNF-α 單克隆抗體和兔抗IL-6多克隆抗體均購自Proteintech；隱血測試盒（聯(lián)苯胺法）購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海生物生工有限公司；糖原PAS 染色液和天狼星紅染色試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）購自北京酷爾化學有限公司。TGL-18000CR 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；TS2R 倒置熒光顯微鏡（Nikon）；ESP-300電泳儀，VE-180 垂直電泳槽和VE-186 轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 實驗動物

雄性 BALB/c 小鼠（42 只，體重 25～30 g）購自南京醫(yī)科大學，許可證號為SCXK（蘇）2016-0002。

3 方法

3.1 小鼠造模與分組治療 將小鼠分為正常飲水組（normal組）、模型（model）組、紫甘薯花青素（12.5、25、50 和75 mg/kg）組和5-ASA（75 mg/kg）陽性藥物對照組，每組各6 只，實驗前適應性喂養(yǎng)2 周。采用2.5% DSS 溶液自由飲用構建小鼠潰瘍性結腸炎模型，每3 d 配制一次新鮮的DSS 溶液。除正常組給予蒸餾水外，其余各組采用自由飲用2.5%的DSS 溶液連續(xù)7 d，誘導潰瘍性結腸炎模型，第8天開始全部換成蒸餾水。造模第1 天即開始灌胃給藥，除正常組與模型組給予蒸餾水外，其余各組通過灌胃方式給予相對應劑量的藥物，連續(xù)給藥8 d。

3.2 小鼠結腸標本的采集 實驗期間，每天觀察并記錄小鼠的體重變化、活動情況、毛發(fā)色澤、大便性狀和便血情況。造模第9 天脫頸處死小鼠。所獲的腸管分成兩份，一份固定于4%的多聚甲醛，4℃處理3 d 后，將其轉移至70%的無水乙醇于-20℃冰箱保存，另一份則于-80℃超低溫冰箱中保存。

3.3 潰瘍性結腸炎的評估 通過對小鼠體重變化、疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分判斷標準見表1，用結腸長度、組織學損傷來評估小鼠的潰瘍性結腸炎的治療情況和是否成功構建潰瘍性結腸炎模型。取預先通過4%多聚甲醛固定后的結腸組織，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察結腸組織病變情況，并對小鼠結腸組織切片進行組織學損傷評分，判斷標準見表2。每個組織切片隨機選取3個以上高倍視野（×400），由2人進行盲法評分，取平均值作為最終結果。

表1 疾病活動指數(shù)評分判斷標準Table 1.The score scales for the disease activity index

表2 組織學損傷評分判斷標準Table 2.The criterion for judgement of histological injury score

3.4 免疫組織化學法檢測相關蛋白的表達 小鼠結腸組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，石蠟切片。經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟后使用檸檬酸鈉修復液，用電磁爐沸水中加熱，對其進行抗原熱修復，3%的過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，山羊血清封閉非特異性抗原，加 I 抗兔抗 ZO-1（1∶50），兔抗 occludin（1∶50）、鼠抗 TNF-α（1：200）和兔抗 IL-6（1∶200）4℃過夜。后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，之后經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復染、流水返藍、梯度乙醇溶液和二甲苯脫水，蓋玻片封片。顯微40 倍物鏡下隨機選擇3 個以上視野拍照，利用Image J 軟件對所測目的蛋白進行半定量分析，以其陽性蛋白所占面積表示蛋白表達強度。

3.5 糖原PAS 染色檢測結腸組織杯狀細胞中黏液素的表達 小鼠結腸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，蒸餾水浸洗，滴加高碘酸溶液，室溫放置1.5 h，蒸餾水浸洗，滴加希夫試劑于37℃烘箱中浸染20 min，蒸餾水沖洗10 min，入蘇木素染核1.5 min，酸性乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗10 min，使其返藍，逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照。

3.6 Western blot 法檢測小鼠結腸ZO-1 和occludin的表達 實驗第9天，取小鼠結腸組織，用RIPA裂解液裂解后勻漿，提取小鼠結腸組織總蛋白，BCA 法測定所得蛋白濃度，8%～12%的SDS-PAGE 分離蛋白，后將蛋白轉移至PVDF 膜上，轉膜后在10%的牛奶中室溫下封閉1 h，后膜于5%BSA 稀釋的Ⅰ抗中4℃孵育過夜，加入帶有HRP標記的Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育2 h，ECL 法發(fā)光，膠片顯影，掃描，保存圖片，ImageJ軟件分析結果。

3.7 天狼星紅染色檢測小鼠結腸纖維化情況 小鼠結腸石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，滴加天狼星紅染色液，室溫孵育1 h，流水簡單沖洗，蘇木素染核8 min，流水沖洗10 min，返藍，脫水，顯微鏡下觀察，拍照。

4 統(tǒng)計學處理

本文所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 6 軟件進行分析。各組之間的統(tǒng)計學差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 紫甘薯花青素對于潰瘍性結腸炎小鼠體重、疾病活動指數(shù)、結腸長度及組織學改變的影響

造模第 9 天，正常組、模型組和12.5、25、50、75mg/kg 紫甘薯花青素組小鼠體重差異明顯。與模型組相比，紫甘薯花青素治療組小鼠體重下降趨勢明顯得到抑制，體重顯著增加（P＜0.05），見圖1A。其DAI 指數(shù)依次0.00±0.00、11.67±0.52、10.00±1.10、3.83±0.75、5.33±0.82、8.17±1.94和7.17±1.60。與正常組相比，模型組小鼠的DAI 評分顯著增加，但紫甘薯花青素治療組與模型組相比DAI 評分顯著降低（P＜0.01），見圖1B。同樣紫甘薯花青素治療組也能改善由于腸炎引起的小鼠腸道變短，見圖1C，紫甘薯花青素能夠明顯增加結腸長度。通過HE 染色來觀察小鼠結腸組織學改變，正常組小鼠結腸結構完整，無炎癥，隱窩完整，杯狀細胞豐富；模型組小鼠結腸壁明顯增厚，炎癥嚴重，病變深度達漿膜層，隱窩完全被破壞，杯狀細胞消失；各劑量紫甘薯花青素組以及陽性藥物對照組均能改善炎癥引起的組織學改變，其中25 mg/kg 組改善效果最為明顯，其治療效果明顯優(yōu)于高濃度的PSPA 組，見圖2。其組織學評分見表3。

Figure 1.The effects of purple sweet potato anthocyanins on body weight（A），disease activity index（B）and colonic length（C）in ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=6.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠體重、疾病活動指數(shù)和結腸長度的影響

Figure 2.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological injury in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with HE staining were showed（×400）.圖2 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠組織學損傷的影響

表3 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠組織學評分的影響Table 3.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological score of ulcerative colitis mice（Mean±SEM. n=4）

2 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白表達的影響

由圖3可見，緊密連接蛋白ZO-1和occludin在正常組中呈陽性表達分布，多為棕黃色染色；與正常組相比，模型組中ZO-1和occludin這2個蛋白的表達均降低，各劑量紫甘薯花青素組以及陽性藥物對照組這2個蛋白的表達均有所升高，其中25 mg/kg的紫甘薯花青素治療組效果最優(yōu)（P＜0.01）。Western blot結果同免疫組化結果類似，同樣也表明25 mg/kg 的紫甘薯花青素對緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達上調效果最優(yōu)，見圖4。

3 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子表達的影響

如圖5所示，模型組小鼠結腸中炎癥因子TNF-α和IL-6 的表達較多，但經(jīng)過紫甘薯花青素治療后，其中炎癥因子表達分布降低，且25 mg/kg 的紫甘薯花青素治療組結腸中的炎癥因子表達分布最少（P＜0.01），要優(yōu)于陽性對照藥物的治療效果。

4 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠黏液素表達的影響

如圖6所示，通過PAS染色技術將小鼠結腸組織杯狀細胞中的粘液素染成紫紅色，模型組中粘液素的表達與分布明顯低于正常組，但經(jīng)治療后杯狀細胞中的黏液素表達與分布明顯增多，且其中25 mg/kg紫甘薯花青素治療組杯狀細胞中的黏液素表達與分布較模型組相比增加最為明顯。

5 紫甘薯花青素對于潰瘍性結腸炎小鼠腸道纖維化程度的影響

如圖7 所示，通過天狼星紅染色來觀察小鼠結腸組織的纖維化情況。模型組的纖維化情況較正常組明顯加重，纖維化主要集中在黏膜下層，經(jīng)紫甘薯花青素治療之后，小鼠纖維化情況得到明顯改善，黏膜下層膠原纖維減少，且其中25 mg/kg 紫甘薯花青素治療組治療效果最為明顯。

討 論

隨著人們飲食習慣的改變，目前潰瘍性結腸炎的患病率在全球范圍內呈持續(xù)上升趨勢，其已經(jīng)嚴重影響了人們的健康。本文以紫甘薯花青素針對腸屏障功能的修復作用來探討其對潰瘍性結腸炎的治療效果。

Figure 3.The effects of purple sweet potato anthocyanin on the expression and distribution of intestinal tight junction proteins in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with immunohistochemical staining were showed（×400）.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖3 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白表達及分布的影響

我們以DSS 為造模藥物，通過2.5%DSS 水溶液自由飲用的方式來構建小鼠潰瘍性結腸炎模型。該造模方法簡單，重現(xiàn)性好，臨床癥狀及病理學改變與人體潰瘍性結腸炎模型類似，適用于針對潰瘍性結腸炎藥物作用的研究［19］。通過體重下降、疾病活動指數(shù)、結腸長度等可以確定模型是否構建成功。本文成功構建了小鼠潰瘍性結腸炎模型，造模后，小鼠均表現(xiàn)出體重下降，進食減少，出現(xiàn)血便等現(xiàn)象，且通過結腸組織學觀察也顯示出小鼠結腸縮短，黏膜糜爛，黏膜下層、漿膜層均被破壞，而陽性對照藥物5-ASA 組與紫甘薯花青素治療組小鼠結腸的組織學狀況均優(yōu)于模型組，炎癥癥狀明顯得到改善，故紫甘薯花青素對于潰瘍性結腸炎具有治療效果。

在正常情況下，腸道具有完整的屏障功能，能防止腸腔內致病性抗原侵入機體，維持機體正常運行。但當腸上皮緊密連接蛋白受損后，腔內各種病原微生物侵入機體，引起黏膜的炎癥和免疫反應［20］。本文通過檢測緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結腸中的分布與表達來判斷結腸的腸道屏障完整性。實驗發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素能夠明顯改善由潰瘍性結腸炎引起的腸道屏障受損，經(jīng)免疫組織化學技術檢測發(fā)現(xiàn)模型組中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結腸中的分布較正常組減少，炎癥因子IL-6 和TNF-α 的分布較正常組增加，經(jīng)Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在模型組中表達下降，炎癥因子TNF-α 在模型組中表達上升，證明潰瘍性結腸炎小鼠的腸道屏障已經(jīng)受損。但是經(jīng)過PSPA 治療后，緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結腸中的分布與表達較模型組均有明顯上升，且炎癥因子IL-6 和TNF-α 的分布與表達均有顯著下降。黏液素為杯狀細胞分泌的，覆蓋在胃腸道上皮細胞表面的黏液，其能夠隔離上皮細胞與各種病原微生物的接觸，當炎癥發(fā)生后，杯狀細胞受損，黏液素分泌減少［21］。利用PAS糖原染色可以將小鼠結腸中的黏液素染成紫紅色。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，模型組中的黏液素明顯減少，但紫甘薯花青素治療組中小鼠結腸組織中的黏液素較模型組明顯增多。表明紫甘薯花青素可能通過維持腸道屏障的完整性來抑制炎癥的發(fā)生，從而達到減輕炎癥的目的。

Figure 4.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of ZO-1 and occludin in the ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.圖4 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達的影響

組織重塑和纖維化是炎癥性腸病的特征，在潰瘍性結腸炎中，結腸黏膜下層的纖維肌閉塞，結腸纖維化嚴重［22-23］。利用天狼星紅染色可以將結腸中的膠原纖維染成紅色。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素能夠有效緩解由潰瘍性結腸炎引起的結腸纖維化狀況。

綜上所述，在由DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型中，體重變化，疾病活動指數(shù)，組織學評分，結腸長度以及結腸纖維化程度均反映紫甘薯花青素能夠明顯改善潰瘍性結腸炎小鼠的癥狀。緊密連接蛋白，炎癥因子以及黏液素的表達情況，初步證明了，紫甘薯花青素可能通過維護腸道屏障的完整性來阻止外界病原微生物進入腸內，從而達到抑制炎癥產(chǎn)生的目的，且其并非呈現(xiàn)出隨劑量上升治療效果越好的趨勢，只有在25 mg/kg 紫甘薯花青素組中治療效果最優(yōu)。DSS 主要是通過增加腸道通透性以及損傷腸道屏障來發(fā)展腸道炎癥，其主要影響上皮細胞緊密連接蛋白如ZO-1 和occludin 等來損傷腸道屏障，從而增加TNF-α和IL-6 等炎癥因子的表達［24-26］。經(jīng)本實驗研究發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素主要通過增加緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達與分布來保護腸道屏障完整性，從而抑制炎癥因子TNF-α 和IL-6 的釋放，改善由DSS 誘導的潰瘍性結腸炎癥狀。本實驗為紫甘薯花青素的藥理研究與功能開發(fā)提供了一些實驗依據(jù)。

Figure 5.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of TNF-α and IL-6 in the ulcerative colitis mice by immunohistochemical staining（×400）of colon sections of mice（A）and TNF-α expression by Western blot（B）.Mean±SEM. n=3.#P＜0.05 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.圖5 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6表達和分布的影響

Figure 6.The effect of purple sweet potato anthocyanin on mucin expression in the ulcerative colitis mice.Glycogen PAS staining of colon sections of mice was showed（×400）.圖6 紫甘薯花青素對潰瘍性結腸炎小鼠黏液素表達的影響

Figure 7.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the degree of intestinal fibrosis in ulcerative colitis mice.Sirius red staining of colon sections of mice was showed（×400）.圖7 紫甘薯花青素對于潰瘍性結腸炎小鼠腸道纖維化程度的影響