糞便菌群移植在慢性乙肝治療中的作用及機(jī)制*

魏 琦， 楊靜楠▲， 何學(xué)良， 何巧靈， 司會方，胡 鴻， 白春洋， 王慧超， 林旭紅△

（河南大學(xué) 1淮河醫(yī)院檢驗科，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，2淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，3第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南開封475000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染而致的肝臟慢性疾病。據(jù)報道，全球大約有2.4 億慢性HBV感染者，其中大多數(shù)患者死于CHB 導(dǎo)致的并發(fā)癥［1］。CHB 患者中有15%～40%會發(fā)展成肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。持續(xù)的HBV 感染及其帶來的并發(fā)癥，給大量家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和健康威脅。常見的抗病毒藥物主要為干擾素和核苷（酸）類似物，雖可阻滯病情進(jìn)展，預(yù)防肝硬化、肝癌、死亡等風(fēng)險，但難以根治乙肝，徹底清除HBV［3］。因此，尋求有效的治療方法是這一領(lǐng)域目前亟待解決的問題。

人體腸道菌群是一個非常復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，隨著腸-肝軸的研究深入，越來越多的證據(jù)表明腸道微生態(tài)紊亂參與了多種肝臟疾病的病理生理過程。肝臟與腸道之間聯(lián)系密切。來自腸道的血液匯入門靜脈激活肝臟功能，肝臟又通過膽汁分泌進(jìn)入腸腔來影響腸道功能［4］。肝臟發(fā)生疾病，使代謝失衡、膽汁產(chǎn)生排泄受阻、免疫機(jī)制障礙，影響細(xì)菌分布，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。而腸道微生態(tài)失衡可破壞腸道黏膜屏障，激發(fā)肝臟炎性反應(yīng)，加重肝臟疾病病情。因此，CHB 和腸道微生態(tài)間存在密切的聯(lián)系。

糞便菌群移植（faecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）是將健康人的糞便上清液通過一定途徑（如鼻胃管或鼻十二指腸管、胃鏡或結(jié)腸鏡、直腸導(dǎo)管灌腸等）輸入到患者腸道內(nèi)，以恢復(fù)或補(bǔ)充正常腸道菌群，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前FMT 已被用于治療艱難梭菌感染、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）和各種肝臟疾病。2017 年廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院率先發(fā)表了FMT 治療CHB 的文章，報道顯示在長期抗病毒治療后乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e-antigen，HBeAg）仍持續(xù)陽性的大部分病例中，F(xiàn)MT 可誘導(dǎo)HBeAg 清除。雖然只有5 名患者參加了FMT 組，但統(tǒng)計數(shù)據(jù)差異顯著（P=0.000 1），這一結(jié)果特別令HBeAg 陽性CHB 患者鼓舞，否則他們無法停止口服抗病毒藥物治療［5］。研究說明，F(xiàn)MT 可能作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，在改善腸道微環(huán)境和清除HBV 方面有著積極的治療作用。但是，有關(guān)FMT 用于治療CHB 的實驗數(shù)據(jù)、臨床數(shù)據(jù)及其機(jī)制研究均仍有限。

本研究通過動物實驗，利用先進(jìn)的高通量測序技術(shù)觀察CHB 發(fā)病過程中腸道內(nèi)菌群的改變，分析CHB 患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并以此為基礎(chǔ)，利用FMT技術(shù)，探討腸道菌群在治療CHB中的作用，研究白細(xì)胞介素 18（interleukin-18，IL-18）及 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號通路的作用及可能機(jī)制，從而為CHB的治療和預(yù)防開辟新途徑，也為輔助CHB的診斷和治療提供新的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6～8 周齡雌雄各半C57BL/6J 小鼠共50 只購自河南省實驗動物中心［許可證號：SCXK（豫）2017-0001］，體重18～22 g，所有動物購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，所有操作程序符合國際實驗室動物護(hù)理和使用指南，并獲得河南大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與器材 pAAV-HBV1.2 質(zhì)粒由臺灣大學(xué)陳培哲教授惠贈；乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）診斷試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）；IL-18 試劑盒（Elixir，I098FC）；恩替卡韋（entecavir，ETV）片（博路定，中美上海施貴寶制藥有限公司）；TAK-242（MedChemExpress，HY-11109）；抗 TLR4 抗體（eBioscience，14-9917-82）；糞便 DNA 提取試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit，Thermo Fisher Scientific）。安圖全自動酶標(biāo)儀PHOMO（安圖生物工程股份有限公司）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCanto）；測序儀（Illumina）。

2 實驗方法

2.1 分組及相應(yīng)的處理 取6～8 周C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為 5 組：對照組、CHB 組、ETV 組、綜合治療（ETV+FMT，EFMT）組和阻斷劑（TAK-242+ETV+FMT，EFMT-TAK）組，每組10 只。對照組小鼠給予正常飼喂，不進(jìn)行任何處理；CHB 組小鼠給予正常飼喂；ETV 組小鼠進(jìn)行常規(guī)ETV 抗病毒治療（75 μg/kg，約每只0.375 mL，每天 1 次灌胃）；EFMT 組在ETV抗病毒治療同時給予糞菌懸液每天灌胃1次，每只約0.5 mL；EFMT-TAK 組腹腔注射TAK-242 溶液（3 mg/kg），每天 1 次，連續(xù) 3 d［6］，然后給予ETV 及糞菌懸液每天灌胃1 次處理。每隔10 d 留取5 組小鼠糞便標(biāo)本，放于-80℃保存。12 周后處死小鼠，取小鼠肝臟組織及血液標(biāo)本。所有操作程序獲得我校醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 造模方法 準(zhǔn)備10 μg 的pAAV-HBV1.2 質(zhì)粒溶于一定體積PBS，使之相當(dāng)于小鼠體重的8%，在5～7 s 內(nèi)將溶液快速注射到小鼠尾靜脈內(nèi)［7］，復(fù)制CHB小鼠模型。

2.3 藥物制備 （1）ETV 溶液制備：將 ETV 片按0.5 mg∶100 mL 的比例溶于生理鹽水。（2）糞菌液的制備［8-9］：收集正常C57BL/6J 小鼠2～4 h 新鮮大便，并移至攪拌器；糞便稱重后，加入約5 倍的無菌生理鹽水，置于攪拌器中進(jìn)行攪拌，混勻后過濾掉殘渣，取混懸液；用自制濾網(wǎng)過濾掉混懸液殘渣，收集懸液；將混懸液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，以1 200 r/min離心3 min；棄掉上清液，添加無菌生理鹽水至原混懸液的量，上下顛倒混勻，再次以上述方法離心，重復(fù)洗滌離心3～5 次；棄去多數(shù)的上清液，最后的沉淀即為提取的量；最后沉淀加入3 倍的生理鹽水，輕輕上下混勻即得到最終糞菌懸液。（3）TAK-242 溶液的制備：將5 mg TAK-242粉末溶于50 μL DMSO中制成貯存液，使用時從中取30 μL 補(bǔ)加無菌雙蒸水至3 mL體積。

2.4 標(biāo)本采集及處理

2.4.1 糞便收集及處理 自制糞便收集籠，自實驗開始之日每隔10 d 收取小鼠糞便，清理干凈混入的食物殘渣，標(biāo)記日期，放于-80℃保存，用于后續(xù)高通量測序檢測。

2.4.2 血液和組織的收集及處理 于實驗總進(jìn)程第12 周處死小鼠。將小鼠放置于有乙醚的密封容器內(nèi)麻醉，摘除眼球取眼底靜脈血約1.0～1.5 mL，置于無菌干燥EP 管中，4℃冰箱保存，用于ELISA 及流式細(xì)胞術(shù)檢測。采血完成后將小鼠固定于手術(shù)臺上，迅速沿腹中線打開腹腔，取出肝臟，4%多聚甲醛固定，用于制作病理切片。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 一般情況 實驗開始后，每天觀察小鼠精神狀態(tài)、活動、進(jìn)食、飲水量、體重、毛發(fā)光澤、大便性狀改變及有無死亡。

2.5.2 肝組織病理學(xué)評分 肝臟炎癥程度根據(jù)Ishak 系統(tǒng)［10］進(jìn)行評分：從門管區(qū)炎癥、界面炎癥、小葉內(nèi)炎癥和融合性壞死4 個維度進(jìn)行評價，以連續(xù)的整數(shù)（0～4 或0～6）表示不同嚴(yán)重程度的炎癥和損傷情況，見表1。

表1 Ishak評分Table 1.The Ishak evaluation system

2.5.3 ELISA 法檢測HBsAg 和IL-18 按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清HBsAg和IL-18水平。

2.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4 取50 μL抗凝血，每管各加2 μL 抗TLR4 抗體，避光放置15 min。加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，冰上放置15 min，至溶液清亮透明。450×g離心 10 min，棄去上清。PBS洗1次，加入200 μL PBS混勻后上機(jī)。

2.5.5 高通量測序進(jìn)行腸道菌群多樣性分析 分別收集5 組糞便樣本，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit提取 DNA 并檢測 DNA 濃度。以 20～30 ng DNA 為模板，通過一系列PCR 引物擴(kuò)增原核生物16S rDNA上包括V3 及V4 的2 個高度可變區(qū)。采用包含“5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'”序列的上游引物和包含“5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'”序列的下游引物擴(kuò)增V3和V4區(qū)。通過酶標(biāo)儀檢測文庫濃度。將文庫定量到10 nmol/L，按MiSeq/NovaSeq（Illumina）儀器使用說明書進(jìn)行雙端測序，由儀器自帶的相關(guān)軟件讀取序列信息。雙端測序得到的正反向reads 首先進(jìn)行兩兩拼接，過濾拼接結(jié)果中含有N 的序列，保留序列長度大于200 bp 的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于 OTU（operational taxonomic unit）聚 類 ，使 用VSEARCH 1.9.6 進(jìn)行序列聚類（序列相似性設(shè)為97%），比對的16S rRNA 參考數(shù)據(jù)庫為Silva 132。然后利用RDP（Ribosomal Database Program）classifier貝葉斯算法對OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。基于OTU 得到分析結(jié)果，采用對樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，分別計算Shannon 和Chao1 等α多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性，通過weighted unifrac 分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異?；贐rary-Curtis樣本間距離矩陣用于主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），以可視化圖顯示β多樣性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）形式表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），之后的兩兩比較，方差齊則采用SNK-q檢驗，方差不齊則采用Dunnett's 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。高通量測序觀察腸道菌群多樣性的統(tǒng)計分析方法見2.5.5和相關(guān)圖注。

結(jié) 果

1 小鼠一般情況

因?qū)嶒炛芷谳^長，造模與灌胃手法問題，操作過程中出現(xiàn)小鼠死亡，因此最終每組小鼠例數(shù)為6 只。與對照組相比，其余組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神倦怠、身體蜷縮、活動遲鈍、進(jìn)食減少、大便性狀改變等情況。CHB 組小鼠以上情況更明顯，且有2 只小鼠分別于第3 周和第6 周出現(xiàn)自然死亡。與對照組相比，CHB 組小鼠體重顯著減輕（P＜0.05）；ETV 組、EFMT 組及EFMT-TAK 組小鼠體重與CHB 組比較有不同程度的回升（P＜0.05）；相較于ETV 組，EFMT 組及EFMT-TAK 組小鼠體重回升更為顯著（P＜0.05）；EFMT-TAK 組與EFMT 組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

2 各組小鼠組織學(xué)損傷的觀察及評分

如圖2 所示，對照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，核圓居中，肝細(xì)胞排列規(guī)則、致密，以中央靜脈為中心向四周呈索狀排列；肝細(xì)胞索間界限清晰，僅散在有少量淋巴細(xì)胞。CHB 組小鼠肝細(xì)胞腫脹，肝索排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)片狀壞死，組織學(xué)評分較對照組顯著升高（P＜0.05）。ETV 組小鼠肝細(xì)胞腫脹，散在炎癥細(xì)胞浸潤，多為點(diǎn)狀壞死，組織學(xué)評分較CHB 組減低（P＜0.05）。EFMT 組多為匯管區(qū)輕度炎癥，散在少量淋巴細(xì)胞，EFMT-TAK 組肝細(xì)胞及肝索排列較為規(guī)則，僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤，這2 組的組織學(xué)評分均較ETV 組降低更為顯著（P＜0.05），其中EFMT-TAK組比EFMT組有進(jìn)一步降低的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Figure 1.Weight loss of the mice in each group.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CHB group；&P＜0.05 vs ETV group.圖1 各組小鼠體重下降情況的比較

Figure 2.HE staining of the liver tissues of the mice in each group（×10）and comparison of the histopathological scores.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CHB group；&P＜0.05 vs ETV group；$P＜0.05 vs EFMT group.圖2 各組小鼠肝組織HE染色和組織學(xué)積分的比較

3 血清HBsAg水平的變化

血清HBsAg 的水平根據(jù)S/COV 值判定，S/COV值≥1 為陽性。正常組小鼠血清HBsAg 均為陰性，S/COV 值 為 0.32±0.12；CHB 組 S/COV 值 為 26.23±4.22，較control組顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)過ETV治療后，S/COV值下降至17.38±4.22，較control組顯著降低（P＜0.05）；EFMT 組S/COV 值下降至6.92±2.22，EFMT-TAK 組 S/COV 值下降至 4.62±1.56，均較 CHB組顯著降低（P＜0.05），均比ETV 組降低更顯著（P＜0.05），EFMT-TAK 組相較于 EFMT 組有進(jìn)一步降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The change of serum HBsAg levels in the mice of each group.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CHB group；&P＜0.05 vs ETV group.圖3 各組小鼠血清HBsAg水平的變化

4 血清IL-18水平的變化

正常組小鼠血清IL-18 水平為（215.09±36.29）μg/L；CHB組小鼠血清IL-18水平為（504.12±36.29）μg/L，較對照組顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)過ETV 治療后，血清 IL-18 水平降至（365.63±49.97）μg/L（P＜0.05）；EFMT組小鼠血清IL-18水平顯著降低至（250.45±38.05）μg/L（P＜0.05），EFMT-TAK組進(jìn)一步下降至（138.00±14.55）μg/L（P＜0.05），均較ETV 組下降更為顯著（P＜0.05），EFMT-TAK 組較EFMT組呈進(jìn)一步下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

5 各組小鼠全血細(xì)胞TLR4表達(dá)的變化

如圖5 所示，對照組TLR4 陽性細(xì)胞比例為（0.73±0.28）%；CHB 組升高至（19.63±4.36）%（P＜0.05）；ETV 組降低至（9.87±2.43）%，EFMT 組進(jìn)一步下降至（5.10±2.98）%，均較CHB 組顯著降低（P＜0.05），EFMT 組與ETV 組比較呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

6 腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

根據(jù)PCoA的可視化圖顯示，對照組與CHB組分為明顯不同的兩群，即表明兩組間菌群的差異度較大；經(jīng)過ETV 治療后，ETV 組與CHB 組相比呈現(xiàn)出菌群結(jié)構(gòu)的高度變異，而EFMT 組則與ETV 組具有一定的相似性，見圖6。

Figure 4.The change of serum IL-18 levels in the mice of each group.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CHB group；&P＜0.05 vs ETV group.圖4 各組小鼠血清IL-18水平的變化

如圖7 所示，在不同水平下各組中一些關(guān)鍵菌群的組成有所不同。以顏色深淺表示此種菌群含量在樣本中的豐度。通過綱水平的熱圖（圖7A）分析可看到，CHB 組Gammaproteobacteria（γ-變形菌）、Deltaproteobacteria（δ-變形菌）和Negativicutes的豐度顯著高于對照組，而Deferribacteres（脫鐵桿菌）和Saccharimonadia的豐度均較對照組降低；給予ETV治療后上述菌群逐漸趨于正常；而在EFMT 組，Del?taproteobacteria和Negativicutes的豐度與對照組更為接近。如圖7B 所示，通過科水平的熱圖分析可以看出，CHB 組Burkholderiaceae（伯克氏菌科）、Desulfovi?brionaceae（脫硫弧菌科）和Veillonellaceae（韋榮氏菌科）的豐度顯著高于對照組；而在ETV 組及EFMT組，上述菌群均逐漸接近于正常。

進(jìn)一步分析比較各組的主要菌群含量差異結(jié)果見圖8。與正常組相比，CHB 組中Acetatifactor、Can?didatus-Saccharimonas、Streptococcus（鏈球菌）和Ru?minococcaceae-UCG-014 的含量顯著減少，而Quinella的含量顯著增多，見圖8A。如圖8B 所示，EFMT 組小鼠糞便中Anaeroplasma、Anaerostipes和Prevotellace?ae-UCG-001 的含量較CHB 組顯著增多，而Quinella和Ruminiclostridium-9 含量顯著減少。而對比ETV組和EFMT 組，主要菌群的含量也呈現(xiàn)出一定的差異，與 ETV 組相比，EFMT 組中Anaerostipes、Lactoba?cillus（乳桿菌）和Streptococcus（鏈球菌）的含量較ETV組增多，而［Eubacterium］-ruminantiumgroup 和Rumi?niclostridium-9的含量較少，見圖8C。

通過α 多樣性指數(shù)直觀地比較組間多樣性的差異程度，可以看出，相較于對照組，CHB 組的多樣性指數(shù)顯著下降；經(jīng)過ETV 治療，多樣性得到回升；EFMT 組的多樣性進(jìn)一步增高，而EFMT-TAK 組的α多樣性則最高，見圖9。

Figure 5.The change of TLR4 positive cell count in the blood of the mice in each group.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CHB group.圖5 各組小鼠全血細(xì)胞TLR4表達(dá)的變化

Figure 6.Comparison of beta diversity index in each group.Principal coordinate analysis（PCoA）was performed using the beta diversity metrics of weighted UniFrac in control， CHB， ETV， EFMT and EFMT-TAK groups.There were apparent differences in the composition of the microbial population in control，CHB and ETV groups.圖6 主坐標(biāo)分析結(jié)果

討 論

HBV 感染已經(jīng)成為全球亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題，目前最常見的治療CHB 的措施是抗病毒治療。當(dāng)前的抗病毒藥物主要包括核苷/核苷酸類似物和聚乙二醇化干擾素，可抑制HBV 復(fù)制并延緩CHB 的進(jìn)展，從而改善 CHB 患者的長期結(jié)局［11-12］。有效的抗病毒藥物雖然能抑制病毒復(fù)制并減少CHB并發(fā)癥的風(fēng)險，但無法根除共價閉合環(huán)狀DNA，且HBV 基因組的變異性導(dǎo)致大量患者在長期使用抗HBV 藥物時產(chǎn)生耐藥性，停藥后易復(fù)發(fā)［13-14］。因此，亟需為慢性乙肝尋找新的治療靶點(diǎn)。

近年來的研究表明，腸道菌群與CHB 的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切。人體腸道菌群是一個復(fù)雜且龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道黏膜是一道天然屏障，維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)腸黏膜受損、腸道屏障通透性增加時，使腸道菌群失衡，大量毒素經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，超過肝臟排毒代謝能力，過度激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，肝細(xì)胞凋亡、壞死及其它臟器功能發(fā)生改變，會引發(fā)或加重慢性肝臟疾病；肝損傷又導(dǎo)致膽汁酸分泌降低，腸道pH 升高從而對腸道定植微生物內(nèi)環(huán)境造成一定的沖擊，導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量改變，即腸道菌群失調(diào)［15］。因此，腸道菌群的改變貫穿了慢性肝臟疾病的病理過程。已有大量研究表明，CHB 患者與正常人的腸道菌群存在顯著差異［16-17］。Lu 等［18］比較了健康人群和 CHB 患者的腸道微生態(tài)，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，CHB 患者腸道微生態(tài)中Faecalibacteriumprausnitzii、Enterococcus faeca?lis和Enterobacteriaceae有顯著升高。與上述結(jié)果相一致，本研究表明，CHB 組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組明顯不同，且經(jīng)恩替卡韋及FMT治療后，在降低HBsAg的同時，菌群逐漸恢復(fù)正常，說明FMT在改善菌群結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。Xu 等［19］的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CHB患者與健康對照間某些菌種物種相對豐度確有顯著差異，而腸道菌群多樣性沒有顯著差異。本研究結(jié)果顯示，CHB 組小鼠較對照組腸道菌群物種豐度改變的同時，多樣性也有顯著下降，且經(jīng)綜合治療后顯著恢復(fù)，表明CHB時，腸道菌群多樣性遭到破壞，經(jīng)FMT 治療后菌群多樣性得到恢復(fù)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)MT 在CHB 的治療中發(fā)揮積極作用，可能與改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性有關(guān)。

Figure 7.The heatmaps of some crucial flora of each sample.A：the heatmap of class level；B：the heatmap of family level.圖7 腸道菌群的熱圖分析

Figure 8.Analysis of the difference in the content of flora in various groups.A：CHB group vs normal group；B：CHB group vs EFMT group；C：EFMT group vs ETV group.圖8 各組間菌群差異分析

Figure 9.The box plot of alpha diversity index in various groups.The abscissa indicates the group name，and the ordinate indicates the value of Chao1 index.Each box in the figure shows the minimum，the first quartile，the median，the third quartile and the maximum of Chao1 index in the sample.圖9 組間多樣性差異箱線圖

目前關(guān)于FMT 治療乙肝的作用及機(jī)制并無定論。有研究表明，IL-18 參與了CHB 的發(fā)病機(jī)制。IL-18 是一種由單核細(xì)胞合成和分泌的促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)T 細(xì)胞增殖及Th1 細(xì)胞發(fā)育和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒性，增強(qiáng)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的產(chǎn)生，在多種感染性疾病、免疫性疾病及炎癥中均發(fā)揮重要作用［20］。目前研究表明，CHB與Th1/Th2比例失衡有關(guān)。CHB 患者表現(xiàn)出特征性的Th1 型細(xì)胞因子分泌減少及Th2 型細(xì)胞因子分泌增多，Th1/Th2 細(xì)胞因子的分泌紊亂，尤其是Th1 型細(xì)胞因子，如IL-12 和IL-18 等的產(chǎn)生缺陷，將會導(dǎo)致HBV 感染者的細(xì)胞免疫功能及輔助B 細(xì)胞功能低下，使病毒不易清除。在HBV 感染期間，乙肝病毒X 蛋白誘導(dǎo)IL-18 在肝臟中的表達(dá)，同時IL-18可誘導(dǎo)CHB患者外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ，并增強(qiáng)其殺死感染細(xì)胞的能力［21-23］。在本實驗中，CHB組IL-18水平顯著升高，這與此前研究相一致。相較于單獨(dú)抗病毒治療，F(xiàn)MT+ETV 治療使IL-18 水平顯著降低，表明綜合治療作用顯著，F(xiàn)MT 治療CHB 可能與降低IL-18 水平有關(guān)。此外，TLR4 在CHB 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TLRs 作為Ⅰ型跨膜模式識別受體，可特異性地識別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattems，PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattems，DAMPs），并在天然免疫中起著免疫監(jiān)視的作用，也可通過其他抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）啟動獲得性免疫，從而在人體天然免疫和獲得性免疫中起著橋梁作用［24-25］。已有研究表明，TLR4 在HBV 感染患者單核細(xì)胞中表達(dá)水平增加［26-27］。本研究也發(fā)現(xiàn) CHB 組 TLR4 水平顯著高于對照組，推測HBV 感染后可能通過上調(diào)TLR4 的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致慢性感染的持續(xù)存在。但同時也有研究表明，TLR4 在HBV 感染患者單核細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著減少，這可能與HBV 感染時機(jī)體的免疫狀態(tài)、病毒復(fù)制水平和肝臟的受損情況不同有關(guān)，因此仍需進(jìn)一步驗證。本研究結(jié)果表明，阻斷小鼠TLR4后，再給予FMT+ETV 綜合治療，效果顯著。這也表明，TLR4 在CHB 的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

本研究也存在不足之處，如造模的技術(shù)要求較高、每組的小鼠例數(shù)較少、小鼠模型和臨床疾病存在差距等。這些問題有待后續(xù)改進(jìn)。

綜上所述，F(xiàn)MT 在CHB 的治療中發(fā)揮積極作用，其機(jī)制可能與降低IL-18 水平、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性有關(guān)，TLR4信號通路參與其中。FMT可作為CHB 新的治療手段，相關(guān)研究結(jié)果仍需進(jìn)一步證實。