維甲酸X受體對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞自噬的調(diào)控作用*

高 慧， 周卓琳 ， 樓國(guó)強(qiáng)， 張晶晶， 武垣伶， 黃丹娜 ， WU Yi-ming， 王萬(wàn)鐵△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所，浙江溫州325035；2河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院病理科，河南開(kāi)封475000；3Division of Cardiovascular Medicine，University of Iowa Carver College of Medicine，Iowa City，IA 5009，USA）

肺缺血/再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）是指肺組織在缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血流供應(yīng)，組織損傷加重甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象，是威脅患者預(yù)后乃至生命的重要因素［1］。LIRI 的發(fā)生發(fā)展最終是由肺細(xì)胞的損傷來(lái)體現(xiàn)的，因此肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell type Ⅱ，AECⅡ）的缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）與機(jī)體的LIRI有類(lèi)比性。細(xì)胞自噬是真核生物體內(nèi)進(jìn)化高度保守的細(xì)胞自穩(wěn)程序［2］，近年來(lái)被證實(shí)參與了某些臟器缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程［3］。因此，研究細(xì)胞自噬可能對(duì)肺缺血/再灌注（缺氧/復(fù)氧）損傷的防治有一定意義。

維甲酸X 受體（retinoid X receptor，RXR）是細(xì)胞核受體超家族中的重要成員之一，包括α、β 和γ 三個(gè)亞型，在細(xì)胞生物學(xué)的特定方面如細(xì)胞增殖、凋亡等多種細(xì)胞過(guò)程中扮演重要角色［4-5］。研究表明，RXRα 在多種疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，激動(dòng)RXR可以抑制缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞損傷［6-7］，但對(duì)于RXR 在肺細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的調(diào)節(jié)作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行H/R 處理，模擬人體LIRI 這一病理生理過(guò)程，并使用RXR 激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)，探討RXR 在H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬過(guò)程中可能發(fā)揮的作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為肺缺血/再灌注損傷的研究和防治提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，由上海拜力生物科技有限公司提供。

2 主要試劑及儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶（Gibco）；9-順式維甲酸（9-cis-retinoid acid，9-RA）和HX531（Sigma）；抗 RXRα、p-AMPK、p-mTOR、beclin 1、LC3-Ⅱ和P62抗體（Abcam）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）；免疫熒光Ⅱ抗（上海翊圣生物科技有限公司）；引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；CCK-8 試劑盒（Dojindo）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）。常氧培養(yǎng)箱和微量冷凍離心機(jī)（Themo）；超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈安泰醫(yī)療器械有限公司）；多功能酶標(biāo)儀、梯度PCR 儀和蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；透射電鏡及成像系統(tǒng)（Hitachi）。

3 主要方法

3.1 AEC Ⅱ的培養(yǎng) 使用DMEM 高糖型培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組 按照隨機(jī)數(shù)表將細(xì)胞分為5 組：對(duì)照（control，Con）組、缺氧/復(fù)氧（H/R）組、溶劑DMSO組、RXR 激動(dòng)劑 9-RA 組和 RXR 拮抗劑 HX531 組。Con 組用完全培養(yǎng)液在常氧箱內(nèi)正常培養(yǎng)30 h；H/R組缺氧（94% N2、1% O2、5% CO2）處理6 h，復(fù)氧處理24 h；DMSO 組在缺氧前用終濃度低于0.1% DMSO的培養(yǎng)液處理1.5 h；9-RA 組在缺氧處理前用9-RA（100 nmol/L）預(yù)處理1 h；HX531 組在缺氧前先用9-RA（100 nmol/L）預(yù)處理 0.5 h，再用 HX531（2.5 μmol/L）預(yù)處理1 h，其余處理同H/R組。

3.3 AEC Ⅱ缺氧/復(fù)氧損傷模型的制備 在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)整合改進(jìn)構(gòu)建大鼠 AEC Ⅱ的 H/R 模型［8］。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，形態(tài)正常的AEC Ⅱ用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理24 h后，用于H/R 模型復(fù)制。缺氧（37℃、94%N2、1%O2、5%CO2）處理時(shí)，將含10%FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)液換成經(jīng)高純氮?dú)怙柡吞幚磉^(guò)的無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液，營(yíng)造氧糖剝奪的條件處理6 h，復(fù)制缺氧模型；再將缺氧液換成無(wú)血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液，置于常氧箱（37℃、95% O2、5% CO2）恢復(fù)氧氣供應(yīng)培養(yǎng)24 h，復(fù)制復(fù)氧模型。通過(guò)以上處理，模擬細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的病理生理過(guò)程。

3.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟正確操作，每孔按照1×105的細(xì)胞密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行各組模型復(fù)制。配制CCK-8混合液（CCK-8∶DMEM 培養(yǎng)液=1∶10），每孔110 μL加入樣品孔，將96孔板放入常氧箱孵育0.5～2 h。再用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm的吸光度（A）值。

3.5 免疫熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞RXRα 表達(dá)準(zhǔn)備細(xì)胞爬片、4%多聚甲醛固定細(xì)胞、0.1% Triton X-100打孔、5%牛蛋白血清封閉之后，再滴加兔抗鼠RXRα 抗體低溫過(guò)夜孵育，次日結(jié)合羊抗兔熒光Ⅱ抗，用DAPI 進(jìn)行核染色，再用含抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片處理之后，于正置熒光顯微鏡下觀察并拍片。

3.6 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 各組細(xì)胞處理完畢，首先用2.5%戊二醛固定液固定30 min，收集細(xì)胞并置于4℃冰箱固定過(guò)夜。再依次經(jīng)PBS 緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水、浸透，Epon812 環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋聚合，半薄切片，超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，最后使用透射電鏡觀察并拍攝。

3.7 RT-PCR 檢測(cè)自噬相關(guān)基因mRNA 的表達(dá) 用Trizol 法提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，根據(jù)濃度計(jì)算上樣體積。依次經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR 擴(kuò)增、2.0%瓊脂糖凝膠電泳、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，最后用Quantity One 軟件分析圖像。PCR 擴(kuò)增參數(shù)為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。此外，LC3 擴(kuò)增參數(shù)為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72℃5 min。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.8 Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 造模結(jié)束，用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗3 次。每皿加1 mL裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100）于冰上裂解 30 min。細(xì)胞刮適當(dāng)研磨細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并離心沉淀，收集上清。BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，高溫下蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）、10%脫脂牛奶封閉 2 h，TBST 洗膜，再結(jié)合I 抗（p-AMPK、beclin 1、p-mTOR、P62 抗體均以 1∶1 000 稀釋?zhuān)籐C3-Ⅱ以 1∶2 000 稀釋?zhuān)籊APDH 以 1∶10 000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日結(jié)合Ⅱ抗約1 h，TBST 洗膜3 次，滴加ECL 發(fā)光液暗室內(nèi)孵育2 min，再用熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍攝，用Quantity One 軟件分析圖像灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)組間采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞活力的變化

與Con 組相比，其余4 組細(xì)胞的A值均顯著下降（P＜0.05）；與DMSO 組相比，9-RA 組的A值顯著上升（P＜0.05）；與 9-RA 組相比，HX531 組的A值顯著降低（P＜0.05）；而H/R、DMSO 和HX531 組之間兩兩相比，A值無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression change of A value in all groups.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖1 CCK-8法檢測(cè)的各組細(xì)胞A值變化

2 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞RXRα表達(dá)的結(jié)果

熒光顯微鏡下可見(jiàn)，與Con 組相比，其余4 組細(xì)胞中的 RXRα 表達(dá)增多；而與 DMSO 組相比，9-RA 組的 RXRα 表達(dá)增多；與 9-RA 組相比，HX531 組細(xì)胞的 RXRα 表達(dá)顯著減少；而 H/R、DMSO和HX531 3組兩兩相比，細(xì)胞中RXRα 表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

3 各組細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果

透射電鏡下可見(jiàn)，Con組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，線粒體結(jié)構(gòu)呈梭形，結(jié)構(gòu)正常，數(shù)目豐富且嵴線清晰，板層小體豐富且結(jié)構(gòu)正常；與Con 組相比，其余4 組細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的紊亂，其中H/R、DMSO 和HX513 3 組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生高度水腫，線粒體嵴線溶解甚至消失，偶見(jiàn)變異性的增生，板層小體出現(xiàn)空泡化且數(shù)目減少，可觀察到自噬溶酶體、降解性細(xì)胞自噬體出現(xiàn)；9-RA組相較于 H/R、DMSO和HX531 3 組，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷減輕，線粒體僅出現(xiàn)輕微腫脹，結(jié)構(gòu)相對(duì)較為完整，板層小體數(shù)目較多且結(jié)構(gòu)正常，未觀察到細(xì)胞自噬小體，見(jiàn)圖3。

4 各組細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與 Con 組相比，其余 4 組細(xì)胞的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表達(dá)均顯著增多，mTOR 和P62 mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與H/R、DMSO 和HX531 組相比，9-RA 組的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表達(dá)水平顯著下降，而mTOR 和P62 mRNA 表達(dá)顯著增多（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 組兩兩相比，各個(gè)自噬基因的mRNA 表達(dá)變化無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

5 各組細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果

與Con 組相比，其余4 組細(xì)胞的p-AMPK、beclin 1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均有顯著增多，p-mTOR 和P62蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與 H/R、DMSO 和HX531 組相比，9-RA 組的 p-AMPK、beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平顯著下降，而p-mTOR、P62 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 組兩兩相比，各個(gè)自噬基因蛋白的表達(dá)變化無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

肺缺血再灌注損傷作為一種機(jī)制極為復(fù)雜的病理生理過(guò)程，目前尚無(wú)特異性防治措施，但藥物預(yù)處理、抑制NF-κB 和前列腺素E1 預(yù)處理等可在一定程度上緩解LIRI［9-11］。而對(duì)于肺組織的主要效應(yīng)細(xì)胞，AECⅡ的缺氧/復(fù)氧損傷可以模擬肺的缺血再灌注損傷。近年來(lái)，大量研究表明缺血再灌注（缺氧/復(fù)氧）損傷的發(fā)生發(fā)展可能受自噬相關(guān)基因（autophagy associated gene，ATG）和自噬信號(hào)通路的調(diào)控［12］。

本研究選擇了多個(gè)自噬通路上有典型指示作用的自噬相關(guān)蛋白。在自噬信號(hào)通路中，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是上游的能量和營(yíng)養(yǎng)感受器。當(dāng)組織細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，ATP 減少而AMP增多，AMPK 活性增加，而mTOR 失活并釋放UNC-51樣激酶1（unc-51-like kinase 1，ULK1），AMPK-ULK1相互作用引起ULK1 磷酸化從而促進(jìn)自噬［13-14］。Ⅱ型微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）作為自噬的標(biāo)志性蛋白，是由LC3-I轉(zhuǎn)化而來(lái)，定位于自噬體膜，故LC3-Ⅱ的蛋白水平可直接反映自噬體的數(shù)量［15］。P62 是選擇性細(xì)胞自噬程序中的關(guān)鍵蛋白，其LIR 結(jié)構(gòu)域可與LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，從而削弱LC3-Ⅱ在自噬體中的作用，因此P62 的表達(dá)與細(xì)胞自噬活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，起到指示自噬底物降解程度的作用［16-17］。自噬相關(guān)基因6（beclin1）是重要的腫瘤抑制蛋白，在ULK1作用下，beclin 1的Ser 14位點(diǎn)磷酸化從而激活PI3KⅢ復(fù)合物，進(jìn)而對(duì)下游自噬體的形成起到重要作用［18-19］。

Figure 2.The expression changes of RXRα and the relative cell fluorescence of RXRα in all groups.The red arrow points to the nucleus，and yellow arrow points to RXRα.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖2 各組細(xì)胞RXRα的表達(dá)變化及熒光強(qiáng)度

RXR 是甾體激素受體超家族中的重要成員之一，其中又以RXRα 的研究最為廣泛［4］。RXRα 存在多種組織器官中并參與了細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等［20］。對(duì)于組織細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷，有研究證實(shí)激動(dòng)RXR 可以減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞自噬有關(guān)［7］。因此，本研究通過(guò)運(yùn)用RXR 激動(dòng)劑9-RA 受體及RXR 拮抗劑HX531后，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞RXRα 的表達(dá)，觀察RXR 激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)細(xì)胞的干預(yù)效果。本研究免疫熒光結(jié)果顯示，9-RA組的RXRα表達(dá)增多，而HX531 組細(xì)胞的 RXRα 表達(dá)顯著減少，證實(shí) RXR 激動(dòng)劑和拮抗劑的確可以調(diào)整AEC Ⅱ中RXRα 的表達(dá)。

通過(guò)對(duì)AECⅡ進(jìn)行缺氧/復(fù)氧、加用RXR 激動(dòng)劑和拮抗劑等干預(yù)，CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)顯示，缺氧/復(fù)氧會(huì)引起細(xì)胞活力下降，而激動(dòng)了RXR 后，細(xì)胞活力有所回升。各組細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果也提示，除正常對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷加重，其中H/R、DMSO 和HX531 3 組細(xì)胞內(nèi)可觀察到自噬小體的出現(xiàn)；而9-RA 組相對(duì)來(lái)說(shuō)細(xì)胞損傷減輕，未觀察到明顯的細(xì)胞自噬小體。RT-PCR 與Western blot 檢測(cè)結(jié)果同樣顯示激動(dòng)RXR 后細(xì)胞自噬得到一定程度抑制，而抑制RXR時(shí)細(xì)胞自噬水平上升。

Figure 3.Ultrastructure of the cells in each group under electron microscope.Yellow arrows point to mitochondria，blue arrows point to lamellar bodies，and red arrows point to autophagosomes.圖3 各組細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)

Figure 4.The mRNA expression of AMPK，beclin 1，LC3，mTOR and P62 in each group.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖4 各組細(xì)胞AMPK、beclin 1、LC3、mTOR和P62的mRNA表達(dá)

Figure 5.The protein levels of p-AMPK，beclin 1，LC3-Ⅱ，p-mTOR and P62 in all groups.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖5 各組細(xì)胞p-AMPK、beclin 1、LC3-Ⅱ、p-mTOR和P62的蛋白水平

綜上所述，在本研究中通過(guò)對(duì)AEC Ⅱ進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，可認(rèn)為缺氧/復(fù)氧成功誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的高表達(dá)，加重了細(xì)胞損傷；而用9-RA 進(jìn)行干預(yù)激活RXRα 能提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞自噬，減輕缺氧/復(fù)氧引起的AEC Ⅱ損傷。提示RXR可能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬，在缺氧/復(fù)氧對(duì)AECⅡ的損傷，這為在體的肺缺血再灌注損傷防治提供了一種新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)。