不同產(chǎn)地五靈脂質(zhì)量評價研究

向陽 陳瑩 黃志軍

摘要 目的：基于HPLC指紋圖譜和穗花杉雙黃酮的含量測定結(jié)果，對不同產(chǎn)地五靈脂藥材質(zhì)量進(jìn)行評價。方法：采用HPLC建立五靈脂指紋圖譜和穗花杉雙黃酮含量測定方法，并運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)和統(tǒng)計軟件進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果：不同產(chǎn)地的五靈脂指紋圖譜和穗花杉雙黃酮含量有其專屬性，其中陜西、山西、安徽、河北四產(chǎn)地的指紋圖譜相似度高，且穗花杉雙黃酮含量>0.020%。結(jié)論：不同產(chǎn)地的五靈脂質(zhì)量存在較大差異，可能與其復(fù)齒鼯鼠食物來源有關(guān)，需控制鼯鼠食物來源，保證市場上五靈脂質(zhì)量穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞 五靈脂;HPLC指紋圖譜;穗花杉雙黃酮;質(zhì)量評價

Abstract Objective：To evaluate the quality of Faeces Trogopterori medicinal materials from different origins based on the results of HPLC fingerprinting and content determination of amentoflavone.Methods：HPLC was used to establish the fingerprints of Faeces Trogopterori and the content determination methods of amentoflavone.The similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatography and statistical software were used to analyze the results.Results：Faeces Trogopterori Fingerprints and the content of amentoflavone in different habitats were specific.Among them，those in Shanxi，Shanxi，Anhui，Hebei and Hubei had high similarity，and the content of amentoflavone was more than 0.020%.Conclusion：There is a great difference in the quality of Faeces Trogopterori from different producing areas，which may be related to the food source of the compound toothed squirrel.It is necessary to control the food source of the compound toothed squirrel to ensure the stability of Faeces Trogopterori on the market.

Keywords Faeces Trogopterori; HPLC fingerprint; Amentoflavone; Quality evaluation

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.003

五靈脂為鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠（Trogopterus Xanthipes Milne-Edwards）的干燥糞便[1-2]，始載于宋《開寶本草》：“五靈脂出北地，寒號蟲糞也”[3]，性溫，味咸、甘，歸肝經(jīng)，臨床主要用于治療痛經(jīng)、血瘀經(jīng)閉、胃潰瘍、蛇蟲咬傷等疾病，現(xiàn)代藥理實(shí)驗表明五靈脂還具有抗炎、清除自由基、抗動脈粥樣硬化、治療慢性心力衰竭等作用[4-10]。復(fù)齒鼯鼠主要分布在山西、河北、陜西、河南、湖北、北京、甘肅、遼寧、吉林、重慶、云南等地[11]，現(xiàn)今陜西商洛已有大量復(fù)齒鼯鼠養(yǎng)殖基地，基地鼯鼠多以側(cè)柏葉為主食。側(cè)柏葉主要含有黃酮類物質(zhì)，是其降血糖、降血脂的有效部位[12-13]，包括槲皮苷、楊梅苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等[8]，其中雙黃酮類是其主要活性成分，特別是穗花杉雙黃酮，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、血管舒張作用等生理活性[14-16]，焦玉提取分離鑒定出五靈脂中也含穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮，并對兩雙黃酮進(jìn)行了含量測定[17]，王嵐等[18]比較了野生與家養(yǎng)五靈脂在藥效方面的差異性，但尚未有文獻(xiàn)報道對多產(chǎn)地的五靈脂進(jìn)行對比分析。本實(shí)驗以陜西產(chǎn)五靈脂為主要研究對象，將陜西五靈脂指紋圖譜和穗花杉雙黃酮含量測定結(jié)果與其與他產(chǎn)地五靈脂進(jìn)行對比，闡明產(chǎn)地對五靈脂質(zhì)量影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ME104E型，AB204-E型）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世）;Dionex高效液相色譜儀（美國戴安）;UA800-DH數(shù)字式超聲波清洗儀（上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司，功率800 W，頻率40 kHz，）;Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）色譜柱;YMC-TriartC18？？柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。

1.2 試劑

穗花杉雙黃酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111902-201102，純度：90.2%）;扁柏雙黃酮（上海源葉生物科技有限公司，批號：YO3N7S13157，純度：91.0%）;乙腈（色譜純，MREDA，美國）;純化水自制;其余試劑均為分析純。

1.3 分析樣品

22批五靈脂藥材產(chǎn)地及來源見表1，根據(jù)本草考證結(jié)果和已收載本品的湖北省級中藥材標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)專著記載情況，確定均為鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠的干燥糞便。

2 方法與結(jié)果

2.1 陜西五靈脂指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SBC18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;以乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫，0～35 min，A相8%～23%;35～45 min，A相23%～40%;45～70 min，A相40%～52%;流速為1.0 mL/min;檢測波長為270 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取穗花杉雙黃酮對照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含約7 μg的溶液作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取五靈脂樣品粉末（過3號篩）約1 g，精密稱定，精密加甲醇50 mL，稱重，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用提取溶劑溶液補(bǔ)足減失重量，濾過，濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.4 精密度試驗

取供試品溶液按照“2.1.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積的RSD值均小于5.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗

取供試品溶液按照上述色譜條件，在0、2、4、6、8、10、12 h測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，12 h內(nèi)7次進(jìn)樣所得圖譜的各色譜峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積的RSD值均小于5.0%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品6份，按照上述供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積的RSD值均小于5.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 陜西五靈脂指紋圖譜構(gòu)建及相似度評價

將產(chǎn)地為陜西的14批五靈脂色譜圖導(dǎo)入運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012年版）進(jìn)行相似度評價，14批樣品的色譜疊加圖譜見圖1。以170713批樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.5 min，以中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動匹配后生成陜西五靈脂對照指紋圖譜，并標(biāo)定8個共有峰，經(jīng)指認(rèn)其中6號峰為穗花杉雙黃酮、8號峰為扁柏雙黃酮，如圖2所示。根據(jù)指紋圖譜相似度評價結(jié)果，14批五靈脂樣品的相似度均大于0.8，其中13批樣品相似度大于0.9，結(jié)果表明陜西五靈脂質(zhì)量穩(wěn)定。相似度計算數(shù)據(jù)見表2。

2.1.8 陜西五靈脂與其他產(chǎn)地五靈脂的色譜圖比較

將陜西五靈脂與其他產(chǎn)地的五靈脂樣品按文中建立的指紋圖譜條件進(jìn)行色譜圖對比，結(jié)果見圖3，其中從下到上（S9-S1）分別為陜西、四川、新疆、安徽、內(nèi)蒙、河北、甘肅、湖北、山西。以陜西的五靈脂對照圖譜為參照圖譜，四川、新疆、安徽、內(nèi)蒙、河北、甘肅、湖北、山西的五靈脂圖譜相似度分別為0.476、0.079、0.929、0.146、0.957、0.585、0.189、0.960，由此可見各產(chǎn)地的五靈脂質(zhì)量差異大，根據(jù)與陜西五靈HPLC脂指紋圖譜的相似度大小，將樣品分為2類：I類相似度大于80%，II相似度小于80%。其中陜西、安徽、山西、河北相似度大于80%，為I類，新疆、內(nèi)蒙、甘肅、湖北、四川相似度較低，處于7.9%～58.5%之間為II類。

2.1.9 聚類分析

以各樣品8個共有峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 21軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果見圖4，將樣品大致分為2類，I類為陜西、安徽、山西、河北產(chǎn)地五靈脂，II類為新疆、甘肅、內(nèi)蒙、四川、湖北五靈脂，說明產(chǎn)地與五靈脂質(zhì)量有一定影響，聚類結(jié)果與“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”結(jié)果相似。

2.1.10 主成分分析

將22批五靈脂的8個共有峰面積導(dǎo)入到SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果見圖5，PC1=45.57%、PC2=16.93%、PC3=12.33%，共解釋了74.83%的變量，表明此8種成分含量可基本實(shí)現(xiàn)對五靈脂整體質(zhì)量控制，主成分分析大致按照不同產(chǎn)地將22批樣分為2組，與聚類分析相照應(yīng)，同時實(shí)現(xiàn)了對五靈脂產(chǎn)地的鑒別。

2.2 五靈脂中穗花杉雙黃酮含量測定

2.2.1 色譜條件

采用YMC-TriartC18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;以乙腈-0.5%冰醋酸溶液（43∶57）為流動相，等度洗脫;檢測波長為330 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣10 μL。對照品及樣品色譜圖見圖6。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取穗花杉雙黃酮對照品5.22 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，制成每1 mL含0.047 08 mg的溶液作為對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

見“2.1.3”。

2.2.4 線性關(guān)系考察

取上述穗花杉雙黃酮儲備液（濃度為0.047 08 mg/mL）1 mL，2 mL，3 mL、4 mL、5 mL分別定容至100 mL、50 mL、25 mL、25 mL、25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取10 μL，按上述色譜條件測定。以進(jìn)樣量（X：ng）和峰積分面積（Y：μV×s）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=14.655X+2.247 1（r=0.999 6）。結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮進(jìn)樣量在4.71～188.3 ng的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗

取上述對照品溶液按“2.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算RSD值為0.86%（n=6），結(jié)果表明儀器精密性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液（陜西170713批），分別于0、3、6、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計算含量，RSD值為1.02%（n=6），提示供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性試驗

取同一批五靈脂粉末（陜西170713批）6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計算得穗花杉雙黃酮含量的平均值為0.035 25%，RSD值為2.24%（n=6），結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗

取已知含量的五靈脂粉末（陜西170713批）6份，約0.5 g，精密稱定，精密加入對照品溶液（濃度為0.470 8 mg/mL）3 mL，按供試品制備方法制備樣品，測定，計算回收率，結(jié)果見表3，平均回收率為101.66%，RSD值為2.19%（n=6），結(jié)果表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.9 樣品含量測定

對五靈脂22批樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同樣品中穗花杉雙黃酮含量在0%～0.049%范圍內(nèi)，表明不同產(chǎn)地五靈脂中穗花杉雙黃酮含量差異較大。

3 討論

五靈脂主要來源于以側(cè)柏葉為主食的復(fù)齒鼯鼠排泄物，活性成分主要為黃酮類物質(zhì)，如槲皮苷、楊梅苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等，在指紋圖譜研究過程中，為了盡可能多的提取主要代表性成分，本研究分別比較了超聲和回流2種提取方式，并考察了甲醇和乙醇2種不同溶劑的提取效果。此外，考察了樣品在220 nm、250 nm、270 nm、300 nm等不同波長下的吸收情況。研究結(jié)果表明：五靈脂藥材采用甲醇回流提取，在270 nm波長下檢測，出峰個數(shù)最多，峰形較好，基線平穩(wěn)，因此選擇條件下確保了所建立的指紋圖譜共有模式更有代表性。

筆者在前期對其他產(chǎn)地五靈脂研究基礎(chǔ)上，分別選取了來源于陜西、安徽、山西、河北、新疆、甘肅、內(nèi)蒙、四川、湖北等產(chǎn)地具有代表性批號的五靈脂樣品，用已建立的陜西五靈脂HPLC指紋圖譜為對照，對其他產(chǎn)地五靈脂進(jìn)行相似度評價，色譜圖相似度分析結(jié)果與共有峰面積聚類分析、主成分分析結(jié)果一致，將五靈脂分為2類，陜西、安徽、山西、河北產(chǎn)地五靈脂為一類，新疆、甘肅、內(nèi)蒙、四川、湖北五靈脂為另一類，這說明安徽、山西、河北復(fù)齒鼯鼠飼養(yǎng)條件同陜西一致，而新疆、甘肅、內(nèi)蒙、四川、湖北可能以其他食物為主，側(cè)柏葉為輔，具體食材還有待考察。同時，以側(cè)柏葉中代表性活性成分穗花杉雙黃酮為評價指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于內(nèi)蒙、湖北、新疆的五靈脂中穗花杉雙黃酮未檢出，而其相應(yīng)的指紋圖譜相似度偏低，結(jié)合聚類分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這幾個產(chǎn)地五靈脂均歸為II類，可見不同評價方法結(jié)果具有一致性。本研究將指紋圖譜整體性評價與代表性活性成分含量評價相結(jié)合，可更全面的評價藥材質(zhì)量，且后續(xù)應(yīng)用中可進(jìn)一步控制五靈脂藥材質(zhì)量，有利于減少藥材批間質(zhì)量差異化。

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（2020-03-30收稿 責(zé)任編輯：徐穎）