青黛作用于急性幼粒細胞白血病的可視化“藥靶蛋白模型”分析

王雪 孫長崗

摘要 目的：目前青黛已是治療急性幼粒細胞白血?。ˋPL）的臨床有效藥物，但其分子機制與物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。基于此本研究構(gòu)建青黛與APL可視化藥靶蛋白模型，以探究青黛作用于APL的分子機制。方法：通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索APL微陣列芯片分析APL差異表達基因，使用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選青黛活性成分，結(jié)合PubChem和SwissTargetPrediction匹配活性成分的靶基因并進行富集分析。String用于挖掘并構(gòu)建APL可視化蛋白互作數(shù)據(jù)，將其讀入Cytoscape，通過Centiscape實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。綜合APL差異表達基因，通過Sybyl與青黛活性成分構(gòu)建藥靶蛋白模型。結(jié)果：篩選出3張APL微陣列芯片，164個差異表達基因，9種青黛活性成分，541個靶基因，這些靶點較多地參與細胞凋亡、藥物結(jié)合、癌癥途徑、慢性粒細胞白血病等，這些都在APL中起重要作用。拓撲分析顯示ELANE，CTSS為核心基因，將其與青黛9種活性成分進行藥靶蛋白模型預(yù)測，顯示靛玉紅和靛藍與核心基因結(jié)合度最佳。結(jié)論：APL是受多基因調(diào)控的復(fù)雜疾病，而青黛成分中靛玉紅和靛藍可通過結(jié)合ELANE，CTSS作用于APL的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞 急性幼粒細胞白血病;青黛;藥靶蛋白模型;靛玉紅;靛藍;基因;網(wǎng)絡(luò)藥理;生物信息

Abstract Objective：Atpresent，NaturalIndigohasbeenusedasaclinicaldrugforthetreatmentofacutepromyelocyticleuke-mia（APL），butitseffectivemolecularmechanismandmaterialbasisarestillunclear.ThepurposeofthisstudyistoconstructthevisiblemodelofNaturalIndigoandAPLdrugtargetprotein，andtoexplorethemolecularmechanismofNaturalIndigoactingonAPL.Methods：TheAPLmicroarraychipwassearchedthroughtheGEOdatabasetoanalyzethediseasedifferentiallyexpressedgenes.TheTCMSPdatabasewasusedtoscreentheactiveingredientsofNaturalIndigo.PubChemandSwissTargetPredictionwereCombinedtomatchtargetgenesofactiveingredientsandenrichmentanalysisoftargetgeneswasdone.StringwasusedforfurthertextminingandconstructingaAPLvisualproteininteractionnetwork，theinteractiondatawasreadintoCytoscape，thenetworkto-pologyanalysiswasdonethroughthepluginCentiscape.AftercomprehensiveanalysisofAPLdifferentiallyexpressedgenes，SybylwasconstructedofdrugtargetproteinmodelwithNaturalIndigoactiveingredients.Results：ThreeAPLdisease-relatedmicroarraychips，164differentiallyexpressedgenes，9NaturalIndigoactivecomponents，541componenttargetgeneswerescreened.Thesetargetsaremoreinvolvedinapoptosis，drugcombination，cancerpathway，chronicmyelogenousleukemia，etc.，allofwhichplayanimportantroleinAPL.TopologicalanalysisshowedthatELANEandCTSSwerecoregenes，thedrugtargetproteinmodelpre-dictionwiththe9activeingredientsofNaturalIndigoshowsthatindirubinandindigohavethebestbindingtocoregenes.Conclu-sion：APLisacomplexdiseaseregulatedbymultiplegenes.TheindirubinandindigoinNaturalIndigocanactonthedevelopmentofAPLbycombiningELANEandCTSS.

Keywords Acutepromyelocyticleukemia;NaturalIndigo;Drugtargetproteinmodel;Indirubin;Indigo;Gene;Networkpharmacol-ogy;Biologicalinformation

中圖分類號：R285.6 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.004

急性早幼粒細胞白血?。ˋcutePromyelocytic Leukemia，APL）是急性髓系白血病的M3亞型，根據(jù)

其發(fā)熱、出血、貧血、感染和浸潤等臨床表現(xiàn)，可歸類于中醫(yī)“虛勞”“血證”“溫病”等范疇。古代文獻中雖無白血病之名，但有較多疾病癥狀的相似記載。《圣濟總錄》：“熱勞之證，心神躁、面赤、頭痛、眼澀、唇焦、身體壯熱，煩渴不止，口舌生瘡，食欲無味，肢體疼痛，多臥少起或時汗，日漸贏疫者是也”[1]?！端貑枴じ怪姓摗酚涊d：“病至則先聞腥臊臭，出清液，先唾血，四肢清，目眩，時時前后血……病名血枯”[2]?！镀諠健吩唬骸胺驘釀谡撸尚姆螌崯?，傷于氣血，氣血不和，臟腑壅滯，積熱在內(nèi)，不能宣通所致也”[3]。上述癥狀均與APL的臨床表現(xiàn)相似。應(yīng)用全反式維甲酸、三氧化二砷聯(lián)合化療是APL的標準治療方案[4]，這很大程度上提高了疾病緩解率，但是維甲酸綜合征、高白細胞危象、高顱壓綜合征等不良反應(yīng)和高復(fù)發(fā)率促使臨床不斷探究新的治療方法，而中藥效緩、穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性更可以緩解化療的不良反應(yīng)，使中藥成為APL的綜合治療中不可或缺的一部分。周靄祥教授臨床應(yīng)用青黛治療白血病多年[5]，療效確切，但其作用機制尚不明確，值得進一步探究。

1 研究對象

青黛，別名靛花、靛沫、藍靛，為雙子葉爵床科植物馬藍、蓼科植物蓼藍、豆科植物木藍或十字花科植物菘藍的莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末或團塊，味咸苦，性寒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、入營化斑、清肝瀉火等功效，主治溫病熱盛、小兒驚癇、斑疹、吐血、咯血、瘡腫、丹毒、蛇蟲咬傷等。青黛在古代醫(yī)書中的藥用記載始于《藥性論》[6]，君，味甘，平。能解小兒疳熱，消瘦，殺蟲。另《本草求真》[7]云，青黛專入肝，系藍靛浮沫，攪澄，掠出取干而成。

味咸性寒，色青，大瀉肝膽實火及肝經(jīng)郁熱?！侗静菅芰x補遺》[8]所言青黛能收五臟之郁火，解熱度，瀉肝，消食積?？梢娤热藢τ谇圜斓乃幮в兴隙?，而自二十世紀九十年代有大量的成功病例顯示將青黛及其方劑用于治療急性早幼粒細胞白血病有良好的治療效果[9-11]。有研究證實[12]青黛的有效成分靛玉紅具有抗腫瘤活性，用同位素標記前體分別滲入腫瘤組織的DNA、RNA及蛋白質(zhì)的研究顯示，靛玉紅可以抑制急性幼粒細胞白血病患者的白血病細胞的DNA合成代謝，輕微抑制RNA合成，證實青黛有抗腫瘤的作用，但沒有系統(tǒng)的青黛與APL的研究。為詳細的闡明青黛活性成分與APL的相互作用，本文通過構(gòu)建青黛與APL藥靶蛋白模型可視化青黛作用于APL的內(nèi)在機制，為青黛治療APL提供理論基礎(chǔ)。

近年來，隨著系統(tǒng)生物學的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，可視化模型模擬技術(shù)為探索中藥有效成分干預(yù)的內(nèi)在原理，構(gòu)建中醫(yī)藥多靶點精確治療模式提供了可行的研究策略。本研究通過以下方面探究青黛與APL的作用機制：1）檢索APL疾病表達數(shù)據(jù)，并分析差異表達基因;2）篩選青黛的活性成分，預(yù)測活性成分靶基因;3）分析APL差異表達基因與青黛活性成分可能的作用靶基因的關(guān)系，篩選出核心基因;4）核心基因與青黛活性成分構(gòu)建可視化藥靶蛋白模型。通過以上分析來探究青黛與APL的內(nèi)在關(guān)系，為中藥作用于疾病系統(tǒng)的提供理論見解。

2 研究方法

2.1 APL差異表達基因 基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，GENEEXPRESSION OMNIBUS，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院，是現(xiàn)在最大最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源[13]。從GEO中檢索apl的微陣列芯片，設(shè)定篩選條件為“Homosapiens”，共檢索到917張APL相關(guān)芯片。

進一步分析每張芯片的樣本數(shù)據(jù)后確定3張芯片作為APL 的疾病數(shù)據(jù)，即GSE34823，GSE12662，GSE995。將每張芯片的APL疾病樣本和正常對照樣本進行分組，通過GEO2R進行差異表達基因分析，得到差異表達基因后進行篩選，條件設(shè)置為adj.P.Val<0.05且|logFC|>1。

2.2 青黛所含活性成分的收集與處理 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-sp.php）由中華人民共和國藥典記載的499種中藥組成，含有29384種成分，3311種靶點，837種相關(guān)疾病[14]。提供了人體口服生物利用度、半衰期、藥物相似性、Caco-2通透性和血腦屏障等12項重要的ADME相關(guān)特性來進行藥物篩選和評價。通過TC-MSP獲取青黛的活性成分，根據(jù)成分的藥物動力學參數(shù)進行篩選，將口服生物利用度（OB）≥30%且成藥相似性（DL）≥0.18作為篩選條件。結(jié)合有機小分子生物活性庫（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（ht-tp：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測每個活性成分對應(yīng)的靶基因。

2.3 基因分析 DAVID （DAVID：https：//DAVID.ncifcrf.gov/）是一個全面的功能注釋工具，能夠分析大量基因背后的生物學意義[15]。將青黛靶基因上傳至DAVID進行基因本體論（GeneOntol-ogy，GO）和京都基因與基因組百科全書（KyotoEn-cyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）分析，顯示路徑的截止閾值設(shè)為P<0.05。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 String數(shù)據(jù)庫（https：//String-db.org/cgi/input.pl）是一個預(yù)測已知蛋白相互作用關(guān)系的在線數(shù)據(jù)庫，共有5090個物種和24584628種蛋白[16]。Cytoscape是一個專注于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可視化和分析的軟件，其核心是提供基礎(chǔ)的功能布局和查詢網(wǎng)絡(luò)[17]。利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape

3.5.1軟件構(gòu)建APL差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。使用Centiscape2.2對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析。Centiscape2.2插件基于直徑，度數(shù)，壓力，中介性，放射性，緊密度，質(zhì)心值，離心值執(zhí)行拓撲分析，篩選出最顯著的差異表達基因為核心

基因。

2.5 可視化藥靶蛋白分析 應(yīng)用SybylX8.1中的SurflexDock程序構(gòu)建青黛活性成分與APL顯著差異基因的可視化藥靶蛋白模型。在PubChem數(shù)據(jù)庫獲取青黛活性成分的小分子文件作為配體，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載拓撲分析得出的ALP顯著差異基因三維晶體結(jié)構(gòu)作為受體，除去晶體分子所有的水分子和小分子配體，并加極性氫，加載電荷，構(gòu)建活性口袋。再輸入小分子文件，分別構(gòu)建藥靶蛋白模型。用配體受體親和力的一致性評分函數(shù)進行打分，并對藥靶蛋白模型進行觀察、分析。

3 結(jié)果分析

3.1 基因比較分析 通過數(shù)據(jù)庫篩選出青黛的9個活性成分。見表1。成分的作用靶基因541個。

分析APL3張芯片后，發(fā)現(xiàn)GSE34823含有626個差異表達基因，GSE12662含有13481個差異表達基因，GSE995含有2128個差異基因。Veen（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny_old/index.html）在線分析后，得到164個三芯片共同差異基因，即APL差異表達基因。見圖1。將541個青黛作用靶點基因和164個APL差異表達基因比較分析，發(fā)現(xiàn)共同重疊基因10個，分別是ELANE，CFD，CTSS，QPCT，MCL1，TYMP，PRKCH，CCNA1，DYRK2，CTSL。

3.2 青黛靶基因富集功能 通過DAVID6.8工具

對青黛作用靶基因進行GO和KEGG通路的功能富集，從而揭示青黛治療APL的潛在作用機制。結(jié)果得出青黛靶基因主要富集到的功能涉及凋亡過程的負調(diào)控、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖、細胞核等GO功能和癌癥、PI3K-Akt、cAMP、病毒致癌、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等KEGG通路，與APL密切相關(guān)。見圖2。

3.3 APL網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 通過Cytoscape軟件構(gòu)建出APL蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，由145個節(jié)點和824條邊組成。見圖3。根據(jù)拓撲學指標Degreeun-Dir，DegreeunDir值最大的節(jié)點處于PPI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的中心，故選擇DegreeunDir≥17.5%來篩選此網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點，即ITGAM，CXCL8，ELANE，ITGB2，CD86，CTSS等。見圖4。我們綜合分析結(jié)果，篩選出此網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點ELANE，CTSS既是青黛靶基因和APL差異表達基因的共同重疊基因又是PPI網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，故選擇這2個基因最下一步藥靶蛋白構(gòu)建。

3.4 青黛活性成分與APL可視化藥靶蛋白構(gòu)建 通過將2個核心基因ELANE、CTSS與青黛9種活性成分構(gòu)建藥靶蛋白模擬發(fā)現(xiàn)，青黛的活性成分靛玉紅、靛藍與ELANE，CTSS結(jié)合度較高，提示靛玉紅、靛藍干預(yù)ELANE，CTSS可能在青黛治療APL中起重要作用。見圖5。

4 討論

APL是屬于急性非淋巴細胞白血病的惡性腫瘤，占成人急性非淋巴細胞白血病10%～15%，發(fā)病中位年齡約40歲，男女發(fā)病率基本相等[18]。西醫(yī)學認為APL主要的發(fā)病機制為特征性染色體15號和17號染色體分別斷裂并易位t（15;17），在分子水平形成PML-RARα融合基因，其翻譯產(chǎn)物PML-RARa融合蛋白阻滯白細胞正常分化及凋亡，導致骨髓中大量的異常早幼粒細胞堆積，導致APL的發(fā)生[19]。中醫(yī)學認為APL的病因病機主要為正氣虧虛，損傷骨髓，復(fù)感外邪，犯營入血。骨髓是APL的病變部位，溫熱邪毒由表入里或發(fā)為伏火，損傷骨髓，邪毒犯營入血，耗傷陰經(jīng)氣血，導致脾腎虧損，進而累及其他臟腑，最終形成骨髓惡性增殖病變。故APL的治療著重祛熱解毒扶正。眾多醫(yī)家[10，20-21]在治療APL上的不斷探索發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸、三氧化二砷聯(lián)合化療結(jié)合青黛方劑治療能夠降低早期死亡率、獲得更高療效、減少化療不良反應(yīng)等優(yōu)勢。青黛味咸，性寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，《本草經(jīng)疏》謂其“解毒除熱，固其所長”，可清熱、涼血、解毒，在中醫(yī)理論體系指導下治療APL可謂方證相對，促使我們對青黛作用于APL的內(nèi)在機制進行探究。

我們運用藥物與疾病的藥靶蛋白構(gòu)建技術(shù)，來闡述青黛治療APL的有效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療靶點。

將復(fù)雜多樣的中藥成分，以及其活性成分在人體內(nèi)不確定性的相互作用，轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)為主體的系統(tǒng)研究。蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者，其功能的實現(xiàn)，如基因表達調(diào)控，細胞信號轉(zhuǎn)導，細胞增殖、凋亡、分化等均取決于蛋白質(zhì)之間的相互作用[22]。因此，PPI網(wǎng)絡(luò)的研究和分析能夠可視化藥物和疾病的組分、進程和功能。使用算法對研究的PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，可以找到主導疾病生物行為的關(guān)鍵靶點，再與藥物有效成分進行藥靶蛋白分析，篩選出作用于疾病的最有效藥物成分，為臨床應(yīng)用藥物干預(yù)疾病提供理論基礎(chǔ)?；诖?，我們通過TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫篩選青黛有效成分，GEO數(shù)據(jù)庫獲取APL疾病芯片后，構(gòu)建了由145個節(jié)點（蛋白質(zhì)）和824條邊（相互作用）構(gòu)成的APL的PPI，繼續(xù)進行拓撲分析得出2個核心基因ELANE，CTSS，進一步與篩選出青黛的9種活性成分進行藥靶蛋白構(gòu)建，得出作用于APL最相關(guān)的青黛活性成分，即靛玉紅、靛藍。

靛玉紅是是中國經(jīng)典名方當歸龍薈丸的主要活性成分，用于治療慢性粒細胞性白血病[23]。吳琦瑋[24]通過體外試驗發(fā)現(xiàn)，靛玉紅對人早幼粒白血病HL60細胞株和人白血病K562細胞株均具有明顯的抑制作用。更有文獻表明靛玉紅能夠抑制人白血病幼粒細胞合成，靛玉紅與ELANE基因的對接打分為5.4478， 顯示有較好的結(jié)合強度， 而ELANE與中性粒細胞數(shù)量密切相關(guān)，其突變的患者有很高的風險發(fā)展成急性髓系白血病或骨髓異常增生[25]。ArunAK通過對52名遺傳性中性粒細胞減少癥患者進行研究，從患者外周血白細胞中提取基因組DNA，測序進行突變分析發(fā)現(xiàn)ELANE出現(xiàn)不同的基因錯義、移碼或剪接位點變異，延緩中性粒細胞分裂成熟，而導致反復(fù)的細菌感染，導致骨髓疾病的發(fā)生。故靛玉紅作用于ELANE進而干預(yù)骨髓內(nèi)中性粒細胞的異常分化，對APL的治療起到關(guān)鍵作用。

靛藍是青黛的有效成分之一，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。劉麗娟[26]研究靛藍對構(gòu)建體外RAW264.7炎性反應(yīng)細胞模型進行實驗發(fā)現(xiàn)，靛藍通過下調(diào)IL-6的表達來減輕RAW264.7炎性反應(yīng)細胞模型的炎性反應(yīng)，得出靛藍具有抗炎的作用。我們通過藥靶蛋白分析顯示，靛藍與CTSS基因的對接打分是6.0087，顯示有較強的結(jié)合度，而CTSS與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。CTSS是一種與自身免疫性疾病密切相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，在人體的生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)功能。目前已有研究證實CTSS的生物學功能與炎性反應(yīng)通路相關(guān)。更有研究表明，CTSS通過促進細胞外基質(zhì)降解，參與VEGF等生長因子分泌而促進腫瘤血管形成，從而促使血管內(nèi)外腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。而我們進行KEGG通路分析的結(jié)果也顯示青黛活性成分的靶基因通過眾多癌癥途徑包括VEGF信號通路參與APL的反應(yīng)過程，為靛藍起效于APL有力支持。

我們通過藥理分析，得出青黛活性成分的靶基因在生物過程主要富集于細胞凋亡、細胞增殖、細胞遷移、細胞內(nèi)信號傳導、炎性反應(yīng)等;在分子功能方面主要集中于ATP、藥物結(jié)合、血紅素血清素結(jié)合等;在細胞組成方面主要體現(xiàn)在細胞質(zhì)、細胞核、細胞連接等;在通路分析主要富集于癌癥途徑、急性髓系白血病、慢性粒細胞白血病、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路等。這些生理過程都與APL的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。又通過進一步分析得出靛玉紅和靛藍與APL差異表達核心基因ELANE，CTSS有較好的結(jié)合強度。

本研究在臨床應(yīng)用青黛獲取肯定療效的前提下，將青黛作用于APL的內(nèi)在分子機制通過藥物與疾病的藥靶蛋白模型分析，最終發(fā)現(xiàn)青黛的活性成分靛玉紅和靛藍可作用于ELANE，CTSS來干預(yù)APL的發(fā)生發(fā)展。從內(nèi)在分子學和藥理學角度為青黛干預(yù)APL提供了臨床應(yīng)用理論依據(jù)。此外我們構(gòu)建可視化藥物-疾病藥靶蛋白模型，為探究中藥潛在作用機制提供了新模式，也為中藥作用于疾病的展現(xiàn)新見解。

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（2020-03-02收稿 責任編輯：王明）