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    林下參內(nèi)生球毛殼菌FS-01對人參病原真菌的抑制作用

    2020-11-02 02:27:46周春元許世泉閆梅霞崔麗麗華霜王英平
    廣西植物 2020年9期
    關(guān)鍵詞:抑制作用內(nèi)生真菌

    周春元 許世泉 閆梅霞 崔麗麗 華霜 王英平

    摘 要:為探究林下參內(nèi)生真菌球毛殼菌(Chaetomium globosum)FS-01菌株對人參病原菌的抑菌作用,該研究在實驗室條件下,測定了FS-01菌株菌絲、發(fā)酵液和孢子懸浮液對人參黑斑病菌(Alternaria panax)、人參菌核病菌(Sclerotinia schinseng)、人參灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人參立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人參根腐病菌(Fusarium solani)5種人參病原菌的抑制作用。結(jié)果表明:內(nèi)生真菌球毛殼菌FS-01對5種病原菌均有抑制作用,其中,對人參黑斑病菌的抑制作用最高,為30.80%,其次是人參立枯病菌、人參菌核病菌、人參根腐病菌和人參灰霉病菌;發(fā)酵液抑菌實驗結(jié)果表明,在加入內(nèi)生真菌球毛殼菌FS-01菌株發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基上,對人參灰霉病菌的抑制作用最高,為82.09%,其次是人參菌核病菌、人參黑斑病菌、人參立枯病菌和人參根腐病菌;孢子抑菌實驗結(jié)果表明,在加入內(nèi)生真菌球毛殼菌FS-01菌株孢子懸浮液的PDA培養(yǎng)基上,對人參黑斑病菌的抑制作用最高,為83.72%,其次是人參灰霉病菌、人參立枯病菌、人參菌核病菌和人參根腐病菌。綜上結(jié)果認為,內(nèi)生真菌球毛殼菌FS-01菌株對人參病原菌均有很高的抑菌作用,可作為人參病原菌的生防菌株資源。

    關(guān)鍵詞:林下參,內(nèi)生真菌,球毛殼菌,人參病原菌,抑制作用

    中圖分類號:Q945.8

    文獻標(biāo)識碼:A

    文章編號:1000-3142(2020)09-1341-08

    Abstract:To study the inhibitory effects of Chaetomium globosum strain FS-01 against Alternaria panax,Sclerotinia schinseng,Botrytis cinerea,Rhizoctonia solani and Fusarium solani of ginseng pathogens,mycelia,fermentation broth and conidia suspension were tested in laboratory. The results showed that Chaetomium globosum FS-01 had certain inhibitory effects against five kinds of? ginseng pathogens by confront culture. Among them,the highest inhibition rate to mycelia growth of Alternaria panax,reached 30.80%,followed by Rhizoctonia solani, Sclerotinia schinseng, Fusarium solani and Botrytis cinerea; On the PDA plate mixed with Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth,the highest inhibition rate to mycelia growth of Botrytis cinerea,reached 82.09%,followed by Sclerotinia schinseng, Alternaria panax,Rhizoctonia solani and Fusarium solani; On the PDA plate mixed with Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension,the highest inhibition rate to mycelia growth of Alternaria panax,reached 83.72%,followed by Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Sclerotinia schinseng and Fusarium solani. Endophytic fungi FS-01 strain had a significant inhibitory effects,it could be utilized as a biological control resource inhibiting ginseng pathogens.

    Key words:mountain-cultivated ginseng,endophytic fungi,Chaetomium globosum,ginseng pathogen,inhibitory effects

    人參(Panax ginseng)屬五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)多年生草本植物。這種植物具有巨大的藥用價值,其根部常被用來增強脾肺功能,以及預(yù)防心血管疾病、腦血管疾病、慢性代謝綜合癥和糖尿病等(Briskin,2000;Shibata,2001;Yuan et al.,2012)。人參是一種在同一個地方生長緩慢的宿根植物。因此,人參面臨著一系列的環(huán)境脅迫,包括細菌、真菌、線蟲對其侵染。目前,國內(nèi)外已有記載的人參病害有40多種,我國已發(fā)現(xiàn)的人參病害至少有25種以上(王春偉,2011),嚴重影響了人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。人參主要的病原菌有人參黑斑病菌(Alternaria panax)、人參菌核病菌(Sclerotinia schinseng)、人參灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人參立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人參根腐病菌(Fusarium solani)等(鐘嘉麗等,2015;張雷鳴等,2016;盧占慧等,2016;孫卓和楊利民,2015,2016),直接影響了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)。

    目前,防治人參病害主要利用化學(xué)藥劑?;瘜W(xué)藥劑不僅價格昂貴而且對于防治病害的效果較差。此外,過度使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致土壤中微生物環(huán)境的變化。況且,這些化學(xué)藥劑對人類和植物有害,并且可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性(Kalia & Gosal,2011)。用植物內(nèi)生菌防治人參病害國內(nèi)外已有很多報道(李鵬祥等,2013;Eo et al.,2014)。內(nèi)生菌被定義為其生活史全部或部分生活在植物組織內(nèi),通常對寄主植物不造成影響和傷害的微生物類群(Rodriguez et al.,2009;Park et al.,2017)。內(nèi)生菌在植物病害防治中扮演著重要的角色(Chowdhury et al.,2017)。內(nèi)生菌通過激活細胞對病原菌的防御反應(yīng)、氧化反應(yīng)、加固細胞壁、相關(guān)防御酶反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物積累等,從而增強宿主抵御病害的能力(Ernst,2010)。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間,不易受環(huán)境條件的影響,因此,利用內(nèi)生菌防治植物病原菌既是一種環(huán)境友好型又是一種經(jīng)濟有效的方法。

    本研究利用前期從林下參葉片分離的內(nèi)生真菌球毛殼菌(Chaetomium globosum)為研究對象,明確球毛殼菌、孢子懸浮液和發(fā)酵液對人參病原菌的抑制作用,以期更好地防治人參主要病害,并為尋找新型生物菌肥的研制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株 球毛殼菌菌株FS-01 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實驗室提供(周春元等,2019)。人參黑斑病菌(Alternaria panax)、人參菌核病菌(Sclerotinia schinseng)、人參灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人參立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人參根腐病菌(Fusarium solani)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理教研室提供。

    1.1.2供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。PD液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 000 mL。

    1.1.3 儀器和設(shè)備 HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司;PL4002精密電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;BMJ霉菌培養(yǎng)箱,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-IFD潔凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;Nikon TS倒置相差顯微鏡,日本尼康公司;PL4002電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 球毛殼菌FS-01與人參病原菌平板對峙培養(yǎng) 將保存的球毛殼菌FS-01菌株和供試人參病原菌菌株分別轉(zhuǎn)接到PDA平板上,于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)7 d后,用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅。采用兩點對峙平板培養(yǎng)法,將人參病原菌菌餅分別接種于PDA平板一側(cè),距離人參病原菌菌餅1 cm處接入球毛殼菌菌餅,同時以只接種人參病原菌的平板為對照(CK),每個處理重復(fù)3次,置于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)7 d,觀察記錄結(jié)果并拍照(劉彩云等,2015)。抑制率計算公式如下:

    T=(Rc-Rp)/Rc×100%。

    式中:T為抑制率;Rc為只接種人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為對峙培養(yǎng)人參病原菌菌落生長直徑平均值。

    1.2.2 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液對人參病原菌的抑制作用

    1.2.2.1 發(fā)酵液的制備 將保存的球毛殼菌FS-01菌株在PDA平板上活化7 d后,在無菌的條件下,用5 mm打孔器打取10個菌餅,轉(zhuǎn)接到裝有100 mL PD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于黑暗條件下25 ℃、120 r·min-1轉(zhuǎn)速恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)7 d,無菌條件下,將培養(yǎng)的菌液經(jīng)滅菌的雙層紗布過濾除去菌絲,濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心15 min去除沉淀,上清液經(jīng)孔徑為0.22 μm的細菌過濾器過濾得到球毛殼菌FS-01無菌發(fā)酵液,置于冰箱(4 ℃) 中保存?zhèn)溆茫ㄋ斡碌龋?018)。

    1.2.2.2 發(fā)酵液對人參病原菌菌絲生長的抑制作用 吸取2 mL制備好的發(fā)酵液,加入40~45 ℃的PDA平板中,混勻,以加入2 mL無菌水的平板作對照,將人參病原菌菌餅接種于平板中央,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落生長直徑(方中達,1998),抑制率計算公式如下:T=(Rc-Rp)/Rc×100%。

    式中:T為抑制率;Rc為無菌水處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為發(fā)酵液處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值。

    1.2.3 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌的抑制作用 將球毛殼菌菌株在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,用滅菌針刮取分生孢子,加入無菌水配置成孢子懸浮液,用血球計數(shù)的方法將溶液配成濃度為每毫升1×107個孢子懸浮液母液,隨后將母液稀釋成每毫升1×106、1×105、1×104、1×103個不同濃度的孢子懸浮液。吸取1 mL制備好的懸浮液,加入40~45 ℃的PDA平板中,混勻,以加入1 mL無菌水的平板作對照,將人參病原菌菌餅接種于平板中央,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落生長直徑(索相敏等,2018)。抑制率計算公式如下:

    T=(Rc-Rp)/Rc×100%。

    式中:T為抑制率;Rc為無菌水處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為孢子懸液處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 球毛殼菌FS-01菌絲對人參病原菌的抑制作用

    從表1可以看出,球毛殼菌FS-01菌絲對人參病原菌均有不同程度的抑制作用,其中,對人參黑斑病菌的抑制作用最高,為30.80%,其次是人參立枯病菌、人參菌核病菌、人參根腐病菌,抑制率分別為24.37%、21.39%、19.07%,對人參灰霉病菌抑制率最小,為18.53%。當(dāng)球毛殼菌FS-01菌絲與人參病原菌菌絲對峙培養(yǎng)7 d時,均會產(chǎn)生抑制區(qū)域,球毛殼菌FS-01菌絲與人參菌核病菌和人參灰霉病菌培養(yǎng),產(chǎn)生的抑制區(qū)域明顯,與人參黑斑病菌、人參立枯病菌和人參根腐病菌培養(yǎng),產(chǎn)生的抑制區(qū)域不太明顯(圖1)。

    2.2 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液對人參病原菌的抑制作用

    從表2可以看出,球毛殼菌FS-01發(fā)酵液對人參病原菌均有不同程度的抑制作用。其中,對人參灰霉病菌的抑制作用最高,為82.09%,其次是人參菌核病菌、 人參黑斑病菌、 人參立枯病菌,抑制率分別為76.83%、74.04%、73.88%,對人參根腐病菌抑制率最小,為69.22%。在球毛殼菌FS-01發(fā)酵液平板上,人參病原菌菌落被包圍(圖2)。

    2.3 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌的抑制作用

    當(dāng)孢子懸浮液濃度為每毫升1×107個時,球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌均有不同程度的抑制作用,其中,對人參黑斑病菌的抑制作用最高,為83.72%,其次是人參灰霉病菌、人參立枯病菌、人參菌核病菌,抑制率分別為81.99%、76.19%、68.77%,對人參根腐病菌抑制率最小,為62.19%(表3)。在球毛殼菌FS-01孢子懸浮液平板上,人參病原菌菌落被包圍(圖3)。

    3 討論

    目前多采用五氯硝基苯、噁霉靈、多菌靈、咯菌腈、代森錳鋅、多抗霉素、丙環(huán)唑、嘧菌酯等多種化學(xué)農(nóng)藥防治人參病害,但研究表明人參病原菌對以上農(nóng)藥逐漸產(chǎn)生了抗藥性(Saito et al.,2016),亟需尋求新的防治人參病害的方法,以減緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生。內(nèi)生菌生存在植物體內(nèi),有穩(wěn)定的生存空間,可以長期地定殖于植物體A. 球毛殼菌FS-01與人參黑斑病菌對峙培養(yǎng); B. 球毛殼菌FS-01與人參菌核病菌對峙培養(yǎng);? C. 球毛殼菌FS-01與人參灰霉病菌對峙培養(yǎng); D. 球毛殼菌FS-01與人參立枯病菌對峙培養(yǎng); E. 球毛殼菌FS-01與人參根腐病菌對峙培養(yǎng)。

    A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Alternaria panax; B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Sclerotinia schinseng; C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Botrytis cinerea; D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Rhizoctonia solani; E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Fusarium solani.

    A. 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液與人參黑斑病菌對峙培養(yǎng)(反面); B. 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液與人參菌核病菌對峙培養(yǎng)(反面); C. 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液與人參灰霉病菌對峙培養(yǎng)(反面); D. 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液與人參立枯病菌對峙培養(yǎng)(反面); E. 球毛殼菌FS-01發(fā)酵液與人參根腐病菌對峙培養(yǎng)(反面)。

    A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Alternaria panax (reverse side); B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Sclerotinia schinseng (reverse side); C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Botrytis cinerea (reverse side); D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Rhizoctonia solani (reverse side); E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Fusarium solani (reverse side).

    A. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參黑斑病菌對峙培養(yǎng)(反面); B. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參菌核病菌對峙培養(yǎng)(反面); C. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參灰霉病菌對峙培養(yǎng)(反面); D. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參立枯病菌對峙培養(yǎng)(反面); E. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參根腐病菌對峙培養(yǎng)(反面)。

    A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Alternaria panax (reverse side); B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Sclerotinia schinseng (reverse side); C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Botrytis cinerea (reverse side); D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Rhizoctonia solani (reverse side); E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Fusarium solani (reverse side).內(nèi),不易受外界環(huán)境條件的影響,與病原菌可以直接互作,是一類重要的生防菌資源(Aly et al.,2011)。

    球毛殼菌(Chaetomium globosum)是毛殼菌中研究最早的生防菌(Martin & Moore,1995),具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力(Soytong et al.,2001),廣泛應(yīng)用于病害的防治。印容等(2016)研究表明球毛殼菌(Chaetomium globosum)產(chǎn)生的鞘氨醇類物質(zhì),對油菜根腫菌具有較強的抑制作用;蘭楠等(2011)從油菜中分離到的內(nèi)生球毛殼菌YY-11在平板對峙試驗中,對油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、棉花立枯菌(Rhizotonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、油菜白斑病菌(Cerosphorella albo-maculans)、油菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、油菜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)都有抑制作用。本研究以前期獲得的優(yōu)勢菌株球毛殼菌 FS-01為材料,通過內(nèi)生菌菌絲對峙培養(yǎng)、發(fā)酵液和孢子懸浮液抑菌試驗,研究其對5種人參病原菌的抑制作用。研究結(jié)果表明球毛殼菌 FS-01菌株對5種人參病原菌均有不同程度的抑制效果,具有廣譜性,可作為一種潛在的人參病害生物農(nóng)藥。但是,內(nèi)生真菌球毛殼菌 FS-01在活體上對病原菌的抑制能力是否與體外一致,以及抑菌機制、菌株發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的活性成分和化學(xué)結(jié)構(gòu)還有待于進一步深入研究。

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    (責(zé)任編輯 周翠鳴)

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