產(chǎn)殼聚糖酶內(nèi)生真菌的篩選、鑒定及酶活力初步研究

金秋珠 顏楨靈 黃植清 袁?，? 劉廣華 農(nóng)小霞 李鑫 駱海玉

摘 要：植物內(nèi)生真菌是挖掘不同類型殼聚糖酶及發(fā)現(xiàn)新酶的資源寶庫(kù)。該研究從122株柑橘和血散薯內(nèi)生真菌中篩選能產(chǎn)生殼聚糖酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，初步研究酶活力影響因素，為后期其酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)殼聚糖酶內(nèi)生真菌與宿主植物病害防御互作關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。通過(guò)透明圈法初篩結(jié)合液體發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，得到2株可產(chǎn)生殼聚糖酶的內(nèi)生真菌Stdif9和Stdif9-4，并發(fā)現(xiàn)Stdif9-4最高酶活力（0.968 U·mL-1）顯著高于Stdif9（0.780 U·mL-1）。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法將菌株Stdif9-4鑒定為青霉屬菌株，即Penicillium sp. Stdif9-4。通過(guò)DNS試劑法初步研究影響該菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力的因素，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株殼聚糖酶活力具有顯著影響，在培養(yǎng)96 h時(shí)，殼聚糖酶活力達(dá)到最大值。9種金屬離子對(duì)菌株的酶活力具有不同影響，其中Mn2+和Ca2+對(duì)殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用;Ag+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+對(duì)殼聚糖酶活力具有不同程度的抑制作用，并且Ag+的抑制作用最為顯著;K+和Na+對(duì)殼聚糖酶活力無(wú)顯著影響。不同培養(yǎng)代數(shù)菌株產(chǎn)酶活力無(wú)顯著差異，說(shuō)明其產(chǎn)酶活力穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生真菌，殼聚糖酶，酶活力，青霉屬，血散薯

中圖分類號(hào)：Q939.99

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）09-1332-09

Abstract：Endophytic fungi are good sources for exploring high diversity of chitosanase and discovering new enzymes. In this study，chitosanase-producing strains were screened and identified from 122 endophytic fungi associated with citrus and Stephania dielsiana，and the factors affecting the activity of chitosanase were preliminarily studied，in order to provide an experiment basis for further study on the enzymatic properties and the interaction between chitosanase-producing endophytic fungi and host plant resistance to diseases. Two endophytic fungi Stdif9 and Stdif9-4 were found to produce chitosanase by transparent circle method and liquid fermentation method. The highest activity of Stdif9-4 （0.968 U·mL-1） was significantly higher than that of Stdif9 （0.780 U·mL-1）. Stdif9-4 was identified as Penicillium sp. Stdif9-4 by morphological method and sequencing analysis of ITS gene. The factors affecting on the chitosanase activity were studied by DNS reagent method. The results showed that the chitosanase activity reached maximum at 96 h of cultivation. In addition，among the nine metal ions，Mn2+ and Ca2+ had obvious activation effect on chitosanase activity. Ag+，Zn2+，Cd2+，Ba2+ and Fe3+ had different inhibitory effects on chitosanase activity，and Ag+ showed more significant inhibitory effect，while? K+ and Na+ did not show significant effect on enzyme activity. There was no significant differences in enzyme activity between different cultured generations，which indicate that the enzyme activity is stable.

Key words：plant endophytic fungi，chitosanase，enzyme activity，Penicillium，Stephania dielsiana

自1973年Monaghan et al.（1973）首先報(bào)道了殼聚糖酶（chitosanase）是一種不同于幾丁質(zhì)酶的新酶以來(lái)，殼聚糖酶的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究已成為目前的研究熱點(diǎn)。殼聚糖酶不水解膠態(tài)幾丁質(zhì)，但能夠水解完全脫乙酰化的殼聚糖，所以該酶被認(rèn)為是專一性水解線性殼聚糖的酶，主要存在于真菌、細(xì)菌及植物中（魯晶娣等，2018）。近年來(lái)，大量研究表明，殼聚糖酶可以作為生物防治劑，能提高植物的抗病能力，與細(xì)胞壁的降解、營(yíng)養(yǎng)代謝等均密切相關(guān)，在回收利用甲殼素中的氮和碳素等方面也起著重要的作用（Kouzai et al.，2012;Thadathil & Velappan，2014;Radhakrishnan et al.，2017;魯晶娣等，2018）。此外，其水解產(chǎn)物殼寡糖具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合等多種獨(dú)特的生理活性和功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景（Aam et al.，2010;Park & Kim，2010;Jaiswal et al.，2019）。

不同微生物來(lái)源的殼聚糖酶的種類及性質(zhì)具有較大差異。植物內(nèi)生真菌是探索不同種類殼聚糖酶及發(fā)現(xiàn)新酶的資源寶庫(kù)（Rajulu et al.，2011;Venkatachalam et al.，2015）。目前，對(duì)植物內(nèi)生真菌殼聚糖酶的研究仍然極少。植物內(nèi)生真菌是指在其生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物體各類組織內(nèi)而不引起宿主植物產(chǎn)生明顯病害癥狀、與宿主植物互惠共生的真菌（Abdalla & Matasyoh，2014）。Rajulu et al.（2011）首次從陸生植物內(nèi)生真菌中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)修飾酶的菌株，發(fā)現(xiàn)其中37%的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種類型的殼聚糖酶。Venkatachalam et al.（2015）從海藻和海草的117株內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)41%的菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為56%的殼聚糖，66%的菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為38%的殼聚糖，56%的菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為1.6%的殼聚糖。Rajulu et al.（2011）和Venkatachalam et al.（2015）的研究均發(fā)現(xiàn)來(lái)源于不同植物的同種內(nèi)生菌的酶具有高度多樣性。

植物中普遍含有內(nèi)生真菌，種類繁多。從植物內(nèi)生真菌中篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株將有利于發(fā)現(xiàn)種類豐富多樣的殼聚糖酶，也將有利于水解產(chǎn)生多種不同類型的殼寡糖，為農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)及食品工業(yè)等提供更多有利資源。本研究從柑橘和血散薯的122株內(nèi)生真菌中篩選產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，初步研究酶活力影響因素，為后續(xù)進(jìn)一步研究其酶學(xué)特性和功能、明確產(chǎn)殼聚糖酶內(nèi)生真菌與宿主植物互作關(guān)系等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物內(nèi)生真菌

122株植物內(nèi)生真菌為廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室前期從健康柑橘（Citrus spp.）和血散薯（Stephania dielsiana）植株中分離得到。柑橘樣品采自廣西桂林（110°19′44″ E、25°16′13″ N，110°16′36″ E、25°11′5″ N）、梧州（111°1′18″ E、23°29′46″ N）;血散薯采自廣西來(lái)賓市金秀瑤族自治縣（109°59′34″ E、24°16′10″ N）。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112C，上海智城;恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械;恒溫?fù)u床LYZ-2102C，上海龍躍;生物顯微鏡DM3 000，德國(guó)徠卡;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)UV-1 200，上海美普達(dá)。主要藥品試劑：DNS試劑（購(gòu)自優(yōu)品實(shí)驗(yàn)室），殼聚糖（分子量29萬(wàn)，脫乙酰度95%，購(gòu)自浙江玉環(huán)澳興甲殼素有限公司），鹽酸溶液（購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司），氫氧化鈉（購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司），金屬離子鹽（所用的離子Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+均為氯鹽，Ag+為AgNO3）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 活化培養(yǎng)基 用于菌種從低溫保存條件轉(zhuǎn)到室溫條件的活化適應(yīng)，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮的馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 種子液同1.3.1，僅不添加瓊脂。

1.3.3 產(chǎn)殼聚糖酶菌株篩選培養(yǎng)基 參考張濤（2005）的方法，配制初篩和復(fù)篩誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

A組分：1%膠體殼聚糖，pH 5.6。B組分：酵母粉0.1%，K2HPO4·3H2O 0.3%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.14%，NaCl 0.1%，KCl 0.1%，CaCl2 0.02%，瓊脂2%。C組分：土豆汁20%，葡萄糖0.2%，蛋白胨0.5%，酪蛋白0.2%，酵母浸膏0.5%，pH 5.6。以上A、B、C組分均單獨(dú)滅菌。其中，將A、B兩溶液等體積混合制得初篩固體培養(yǎng)基;將A、C兩溶液等體積混合制得復(fù)篩液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 產(chǎn)殼聚糖酶菌株篩選

1.4.1 初篩（透明圈法篩選） 在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌打孔器（直徑4 mm）在已活化的內(nèi)生真菌菌落邊緣取菌餅，轉(zhuǎn)接至初篩培養(yǎng)基平板上，每皿接1塊菌餅，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌株生長(zhǎng)情況，并在有透明圈產(chǎn)生時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量相應(yīng)透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），記錄數(shù)據(jù)并拍照，計(jì)算D/d比值。挑選產(chǎn)透明圈明顯的菌株，進(jìn)一步搖培發(fā)酵檢測(cè)酶活。

1.4.2 復(fù)篩 在超凈工作臺(tái)中，向裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中轉(zhuǎn)接3塊活化的菌餅，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，獲得種子液。用移液槍吸取2 mL種子液接入裝有100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d后，測(cè)定殼聚糖酶活力。

1.5 菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶的菌株進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定菌株主要是通過(guò)不同的培養(yǎng)基（CA、PDA、CYA及G25N）對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，參考《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，1979）、《中國(guó)真菌志》（孔華忠，2007）及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。鑒定特征包括菌落大小、形態(tài)、生長(zhǎng)速率、邊緣特征、菌落及培養(yǎng)基基質(zhì)顏色，以及菌落在顯微鏡下的特征（如菌絲有無(wú)分隔、分支，分生孢子形態(tài)、大小，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征等）。分子生物學(xué)鑒定菌株主要是利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)段具有保守性和特異性序列的特性，以真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增菌株ITS堿基序列，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行檢測(cè)純化及測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果與NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇相似度較高，親緣關(guān)系近的菌株比對(duì)，并用MEGA Ⅹ軟件，對(duì)ITS堿基序列進(jìn)行聚類分析，Bootstrap進(jìn)行自展次數(shù)為1 000的置信度檢測(cè)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的組群關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類。

1.6 殼聚糖酶活力測(cè)定

1.6.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取0.863 g氨基葡萄糖鹽酸鹽（105 ℃烘至恒重），置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，配制成4 μmol·mL-1氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6支洗凈的10 mL試管，依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL濃度為4 μmol·mL-1的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，均加蒸餾水至1 mL，再分別加入1 mL DNS試劑，放入100 ℃的水中反應(yīng)10 min后取出。冷卻后，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。在520 nm波長(zhǎng)處，以0號(hào)管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)定其他號(hào)試管溶液的吸光值。重復(fù)3次測(cè)量，計(jì)算出每支試管吸光值的平均值。

1.6.3 DNS法測(cè)殼聚糖酶活力 參考胡遠(yuǎn)亮（2007）和劉昌燕等（2009）的方法，具體操作如下：首先，取0.5 mL發(fā)酵上清液和0.5 mL 1%膠體殼聚糖溶液，在50 ℃下保溫60 min。然后，向試管中加入1 mL DNS試劑終止反應(yīng)，并轉(zhuǎn)至沸水中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后用流動(dòng)自來(lái)水進(jìn)行降溫。最后，向試管中分別加入蒸餾水至每管溶液體積為10 mL。以煮沸失活的酶液作為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)量520 nm處的吸光值（OD520），根據(jù)氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出其對(duì)應(yīng)的氨基葡萄糖濃度。按照以下公式計(jì)算酶活力：酶活力=（測(cè)定樣組的還原糖量-對(duì)照樣組的還原糖量）×2（稀釋倍數(shù)）/60（時(shí)間）。酶活力定義為每毫升發(fā)酵液每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.7 菌株Stdif9-4產(chǎn)酶曲線測(cè)定

參照毛貴珠等（2012）的方法，并進(jìn)行適當(dāng)改良，按照1.4.2的操作方法，將種子液接入250 mL三角瓶中，每菌接3瓶，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120 h取發(fā)酵液離心（4 000 r·min-1，15 min），按照1.6.3方法測(cè)定上清液酶活力。

1.8 金屬離子對(duì)菌株Stdif9-4酶活力的影響

分別配制濃度為100 mmol·L-1的金屬離子（Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+）溶液，然后分別向混有0.5 mL發(fā)酵上清液和0.5 mL 1%膠體殼聚糖溶液的試管中加入上述金屬離子溶液0.1 mL。按照1.6.3的方法測(cè)定酶活力，每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以不加金屬離子的空白對(duì)照組酶活力為100%，在金屬離子存在條件下的實(shí)驗(yàn)組酶活力相對(duì)于空白對(duì)照組酶活力的比例即為添加金屬離子后的相對(duì)酶活力（高劍鋒等，2012）。即相對(duì)酶活力=實(shí)驗(yàn)組酶活力/空白對(duì)照組酶活力。

1.9 菌株Stdif9-4酶活力穩(wěn)定性測(cè)定

將菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)五代，分別測(cè)定每代菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力，以判斷菌株產(chǎn)酶活力是否穩(wěn)定。從保種管內(nèi)挑出Stdif9-4菌絲進(jìn)行活化，作為第一代，培養(yǎng)3 d即轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，新轉(zhuǎn)接菌株繼續(xù)培養(yǎng)3 d，作為第二代，再轉(zhuǎn)接，以此類推，至第五代。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

建立的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.164 1x-0.003 3（R2=0.999 1），其中x為氨基葡萄糖濃度，y為不同濃度的氨基葡萄糖溶液的吸光值。

2.2 產(chǎn)殼聚糖酶內(nèi)生真菌篩選

利用透明圈法，通過(guò)大量篩選，初步確定透明圈直徑/菌落直徑較大的2株內(nèi)生真菌Stdif9和Stdif9-4（均分離自血散薯塊根）為產(chǎn)殼聚糖酶較好的菌株。進(jìn)一步測(cè)定2株內(nèi)生真菌Stdif9和Stdif9-4發(fā)酵液（培養(yǎng)3 d）的殼聚糖酶活力，結(jié)果如表1所示。發(fā)酵培養(yǎng)3 d的內(nèi)生真菌Stdif9和Stdif9-4對(duì)95%脫乙酰度殼聚糖有較好的酶解作用，其殼聚糖酶活力分別達(dá)到0.780和0.968 U·mL-1，Stdif9-4殼聚糖酶活力顯著高于菌株Stdif9的。

2.3 2株內(nèi)生真菌產(chǎn)殼聚糖酶活力曲線

分別測(cè)定內(nèi)生真菌Stdif9和Stdif9-4在搖培24、48、72、96、120、144、168 h后的產(chǎn)酶活力，以確定其產(chǎn)殼聚糖酶活力最佳培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果如圖1所示。2株內(nèi)生真菌在前72 h產(chǎn)酶活力均較低，72 h后產(chǎn)酶活力迅速增加，并均在96 h時(shí)產(chǎn)酶活力達(dá)到最大值，96 h之后產(chǎn)酶活力開(kāi)始逐漸降低。從酶活力曲線可知，在不同的培養(yǎng)時(shí)間段，Stdif9-4菌株產(chǎn)酶活力均高于Stdif9。因此，后續(xù)選取Stdif9-4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4 內(nèi)生真菌Stdif9-4的鑒定

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)內(nèi)生真菌Stdif9-4進(jìn)行鑒定。參考《中國(guó)真菌志》（孔華忠，2007），根據(jù)顯微形態(tài)圖（圖2），其分生孢子梗上只有一個(gè)分枝點(diǎn)，此分枝點(diǎn)上為單輪生的帚狀枝;分生孢子梗和分子孢子表面平滑;分生孢子球形或近球形。結(jié)合Stdif9-4在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑（表2）和菌落形態(tài)（圖3）初步確定內(nèi)生真菌Stdif9-4為青霉屬（Penicillium）菌株。結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，將其測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其ITS序列與Penicillium sp.的相似性高達(dá)100%。因此，將Stdif9-4鑒定為Penicillium sp. Stdif9-4（GenBank登錄號(hào)為MN238849）。

2.5 金屬離子對(duì)內(nèi)生真菌Stdif9-4殼聚糖酶活力影響

在確定Stdif9-4殼聚糖酶活力最高的發(fā)酵時(shí)間（96 h）的基礎(chǔ)上，測(cè)定了9種金屬離子（Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+，濃度均為100 mmol·L-1）對(duì)酶活力的影響，結(jié)果如表3所示。Mn2+和Ca2+對(duì)Stdif9-4所產(chǎn)的殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用;Ba2+和重金屬離子Ag+、Zn2+、Cd2+、Fe3+對(duì)殼聚糖酶活力都有不同程度的抑制作用，其中Ag+的抑制作用最為顯著;K+和Na+對(duì)殼聚糖酶活力無(wú)顯著影響。

2.6 內(nèi)生真菌Stdif9-4產(chǎn)殼聚糖酶穩(wěn)定性測(cè)定

將內(nèi)生真菌Stdif9-4轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)五代，分別測(cè)定相應(yīng)發(fā)酵液殼聚糖酶活性，發(fā)現(xiàn)酶活性無(wú)顯著差異（圖4）。圖4結(jié)果表明該菌株產(chǎn)酶活力比較穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)平板初篩和液體復(fù)篩，從122株內(nèi)生真菌中篩選到了2株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株。采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)其中產(chǎn)酶活力較高的菌株進(jìn)行鑒定，將其歸為青霉屬。目前，人們從植物內(nèi)生真菌中篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株的研究較少，主要還是從土壤、海洋等環(huán)境中進(jìn)行篩選（Zitouni et al.，2017;Chien et al.，2018;Fukamizo & Shinaya，2019），而且發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶菌株大多數(shù)為青霉屬（Penicillium）或曲霉屬（Aspergillus）（曾嘉，2002;鄭連英和隋斯光，2004;卓少玲，2012;單秋實(shí)，2015）。本研究篩選到的產(chǎn)殼聚糖酶的內(nèi)生真菌Penicillium sp. Stdif9-4也為青霉屬菌株，分離自我國(guó)重要藥用植物血散薯塊根。由于不同來(lái)源的殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)往往有較大差異，Penicillium sp. Stdif9-4來(lái)源于藥用植物，其特殊的生境是否會(huì)使得其殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能有別于其他環(huán)境菌株，其對(duì)殼聚糖的作用類型是內(nèi)切型還是外切型等，后期還需進(jìn)一步研究。此外，不同培養(yǎng)基及不同營(yíng)養(yǎng)成分配比對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)及酶的誘導(dǎo)往往有不同程度的影響，在進(jìn)行初篩的過(guò)程中，由于只用了一種選擇培養(yǎng)基，這很可能會(huì)導(dǎo)致漏篩一部分產(chǎn)殼聚糖酶的菌株。因此，后期可嘗試多種含殼聚糖的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼聚糖酶活力有顯著影響。Peni-cillium sp. Stdif9-4產(chǎn)殼聚糖酶活力在前72 h均較低，72 h后迅速增加，并在96 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。這與張翔等（2018）、張子瑞（2016）報(bào)道的結(jié)果相似。與之相應(yīng)的，王欽宏和蔡靜平（2000）發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶活力最高時(shí)，培養(yǎng)液中活菌數(shù)也達(dá)到了最高水平，并確定3 d為適宜的收獲時(shí)間。推測(cè)可能因?yàn)樵诎l(fā)酵初期，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充裕，菌體大量繁殖，產(chǎn)生大量的殼聚糖酶，后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少及菌體進(jìn)入衰亡期，殼聚糖的產(chǎn)生也隨之減少（熊妍妍等，2018）。本文僅研究了發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼聚糖酶活力的影響，接種量、培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)成分（如碳源、氮源等）以及培養(yǎng)條件（如溫度、pH等）等因素也均可影響殼聚糖酶活力，后期可利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面分析等進(jìn)行綜合分析，以確定最有效促進(jìn)產(chǎn)殼聚糖酶活力提高的條件。

大部分殼聚糖酶活性均可受金屬離子的影響。本研究使用8種氯鹽分別提供了8種金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+及Fe3+）和AgNO3提供Ag+，考察不同金屬離子對(duì)酶活力的影響。其中，Mn2+和Ca2+對(duì)Stdif9-4殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用。相似的，單秋實(shí)（2015）研究發(fā)現(xiàn)金屬離子Mn2+、Ca2+對(duì)來(lái)源于土壤的青霉（Penicillium sp. QS7）殼聚糖酶活力也具有促進(jìn)作用;卓少玲（2012）也發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)來(lái)源于土壤的青霉（Penicillium sp. M-2）殼聚糖酶活力具有促進(jìn)作用。Mn2+和Ca2+對(duì)大多數(shù)微生物來(lái)源的殼聚糖酶活性具有激活作用（曾嘉，2002;郝日光，2005;段妍，2006）。Ba2+和重金屬離子Ag+、Zn2+、Cd2+、Fe3+對(duì)殼聚糖酶活力具有不同程度的抑制作用，K+和Na+對(duì)殼聚糖酶活力無(wú)顯著影響。這與大多數(shù)微生物來(lái)源的殼聚糖酶一致（逄玉娟，2004;段妍，2006;游清徽，2006;王艷君等，2012;張翔等，2018），但也有部分金屬離子對(duì)不同來(lái)源的殼聚糖酶活力起著相反的作用，如在單秋實(shí)（2015）的報(bào)道中，Zn2+對(duì)來(lái)源于土壤的青霉菌（Penicillium sp. QS7）殼聚糖酶活力具有促進(jìn)作用。金屬離子對(duì)酶的影響機(jī)制，可能與金屬離子和底物殼聚糖形成穩(wěn)定的復(fù)合物有關(guān)（陳小娥，2004）;或金屬離子通過(guò)參與殼聚糖酶活性中心的構(gòu)建，結(jié)合酶活性中心以外的部位，增大酶與底物之間的親和力，使酶活力得到增強(qiáng)（Chen et al.，2005;楊立紅等，2013）;或由于金屬離子通過(guò)螯合作用，影響酶的構(gòu)象，干擾酶對(duì)底物的降解作用，從而導(dǎo)致酶活力下降（王艷君等，2012）。并且，不同作用條件如溫度、pH、酶的濃度、底物濃度以及金屬離子本身的濃度都會(huì)影響其作用效果。后期應(yīng)對(duì)以上作用條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步研究不同金屬離子對(duì)菌株殼聚糖酶活力影響機(jī)制。

綜上所述，本研究從血散薯內(nèi)生真菌中篩選到產(chǎn)殼聚糖酶活力穩(wěn)定的青霉屬菌株，并初步研究了影響酶活力的因素。后期將進(jìn)一步研究殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步明確金屬離子促進(jìn)殼聚糖酶活力的最佳濃度、復(fù)合效應(yīng)及其作用機(jī)制，并測(cè)定殼聚糖酶及其水解產(chǎn)物的抗菌活性或誘導(dǎo)活性，及探究其與宿主植物病害防御互作關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

AAM BB，HEGGSET EB，NORBERG AL，et al.，2010. Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine [J]. Mar Drugs，8（5）：1482-1517.

ABDALLA MA，MATASYOH JC，2014. Endophytes as producers of peptides：An overview about the recently discovered peptides from endophytic microbes [J]. Nat Prod Bioprospect，4（5）：257-270.

CHIEN D，THI T，VAN N，et al.，2018. Reclamation of marine chitinous materials for chitosanase production via microbial conversion

by Paenibacillus macerans [J]. Mar Drugs，16（11）： 429-451.

CHEN XE，2004. Study on the characterization and mechanism of chitosanases from Aspergillus sp. [D]. Wuxi：Jiangnan University.? [陳小娥，2004. 曲霉產(chǎn)殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)及作用機(jī)理研究 [D]. 無(wú)錫：江南大學(xué).]

CHEN XE，XIA WS，YU XB，2005. Purification and characterization of two types of chitosanase from Aspergillus sp. CJ22-326 [J]. Food Res Int，38（3）：315-322.

DUAN Y，2006. Study on optimal fermentation conditions of a chitosanase-producing bacterium，purification and characte-rization of the chitosanase [D]. Qingdao：Ocean University of China.? [段妍，2006. 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化、殼聚糖酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究 [D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué).]

FUKAMIZO T，SHINAYA S，2019. Chitin/chitosan-active enzymes involved in plant-microbe interactions [J]. Adv Exp Med Biol，1142（12）：253-272.

GAO JF，LI WX，LI HL，et al.，2012. Screening and enzymatic characteristic of a cellulase producing strain [J]. Hubei Agric Sci，51（8）：1566-1568.? [高劍鋒，李文鑫，李匯龍，等，2012. 一株產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì) [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（8）：1566-1568.]

HAO RG，2005. Breeding of chitosanase-producing strains，optimization of fermentation conditions and study on enzymatic properties [D]. Qingdao：Ocean University of China. ?[郝日光，2005. 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)的研究 [D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué).]

HU YL，2007. Screning of chitosanase-producing mutant and study on its fermentation technology [D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.? [胡遠(yuǎn)亮，2007.? 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的選育及產(chǎn)酶發(fā)酵工藝研究 [D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué).]

JAISWAL S，TRIPATHI P，SINHA S，2019. Biocatalytic production of hetero-chitosan oligosaccharides as anti-oxidants [J]. Sustain Agric Rev，35：125-146.

KONG HZ，2007. Flora fungorum sinicorum [M]. Beijing：Science Press：35：112-115.? [孔華忠，2007. 中國(guó)真菌志 [M]. 北京：科學(xué)出版社，35：112-115.]

KOUZAI Y，MOCHIZUKI S，SAITO A，et al.，2012. Expression of a bacterial chitosanase in rice plants improves disease resistance to the rice blast fungus Magnaporthe oryzae [J]. Plant Cell Rep，31：629-636.

LIU CY，JIN L，LIU YY，et al.，2009. Screening of chitosanase-producing fungi from soil [J]. Chin J Microecol，21（9）：776-778.? [劉昌燕，金玲，劉穎穎，等，2009. 土壤中產(chǎn)殼聚糖酶真菌的篩選 [J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，21（9）：776-778.]

LU JT，WEI PQ，ZHANG XM，et al.，2018. Research progress of chitosanase [J]. Chin Cond，43（12）：168-173.? [魯晶娣，韋盤(pán)秋，張興猛，等，2018. 殼聚糖酶的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)調(diào)味品，43（12）：168-173.]

MAO GZ，ZHANG HM，SHAO YF，et al.，2012. Screening and identification of chitosanase-producing microorganisms from soil and optimization of the fermentation conditions [J]. Hubei Agric Sci，56（10）：1913-1917.? [毛貴珠，章曄敏，邵一凡，等，2012. 產(chǎn)殼聚糖酶土壤微生物的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，56（10）：1913-1917.]

ZENG J，2002. Purification and immobilization of chitosanase from Penicillium sp. ZDZ1 [D]. Hangzhou：Zhejiang University.? [曾嘉，2002. 青霉屬菌株產(chǎn)殼聚糖酶的分離純化及固定化的研究 [D]. 杭州：浙江大學(xué).]

ZHANG T，2005. Purification and characterization of a novel chitosanase from Metarhizium guizhouense in solid-state fermentation [D]. Chengdu：Sichuan University.? [張濤，2005. 產(chǎn)殼聚糖酶真菌的篩選與綠僵菌固態(tài)發(fā)酵以產(chǎn)殼聚糖酶以及酶的分離純化和性質(zhì)研究 [D]. 成都：四川大學(xué).]

ZHANG X，ZHANG YH，LIU XY，et al.，2018. Optimization of fermentation conditions of the chitosanase-producing strain ncps116 and enzymatic properties of the chitosanase [J]. Chem Ind Eng Prog，37（6）：2354-2363. [張翔，張彥昊，劉孝永，等，2018. 產(chǎn)殼聚糖酶菌株ncps116發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì) [J]. 化工進(jìn)展，37（6）：2354-2363.]

ZHANG ZR，2016. Identification，fermentation and characte-rization of a marine bacterium Y-116 producing chitosanase [D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.? [張子瑞，2016. 一株產(chǎn)殼聚糖酶的海洋菌株Y-116的鑒定、產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)研究 [D]. 上海：上海海洋大學(xué).]

ZHENG LY，SUI SG，2004. Screening and mutagenesis of chitosanase-producing strain and study on the optimal conditions of chitosanase formation [J]. J Zhejiang Univ （Eng Sci Ed），38（8）：106-109.? [鄭連英，隋斯光，2004. 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的誘變育種及其產(chǎn)酶條件研究 [J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），38（8）：106-109.]

ZHUO SL，2012. Screening of chitosanase-producing strain and research on immobilization of chitosanase [D]. Fuzhou：Fujian Normal University.? [卓少玲，2012. 殼聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選及酶的固定化研究 [D]. 福州：福建師范大學(xué).]

ZITOUNI M，VIENS P，GHINET MG，et al.，2017. Diversity of family GH46 chitosanases in Kitasatospora setae KM-6054 [J]. Appl Microbiol Biotechnol，101：7877-7888.

（責(zé)任編輯 周翠鳴）