血管生成素-2上調(diào)增強血管瘤干細(xì)胞血管形成能力的研究

張明亮 吳杉英 王彪 劉照亮 雷忱

[摘要]目的：探究Ang2上調(diào)后對血管瘤干細(xì)胞（HemSCs）血管形成能力的影響，揭示Ang-Tie2體系在血管瘤血管發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法：通過免疫磁珠陽性分選技術(shù)分離純化HemSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法獲得Ang2上調(diào)穩(wěn)定表達(dá)的HemSCs。通過血管形成實驗檢測Ang2上調(diào)的HemSCs血管形成能力的變化，通過WesternBlot檢測相關(guān)細(xì)胞信號通路關(guān)鍵靶蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：Ang2上調(diào)的HemSCs血管形成能力大于對照組;血管生成信號通路關(guān)鍵靶蛋白在HemSCs Ang2上調(diào)組中表達(dá)增強。結(jié)論：Ang2上調(diào)可以增強HemSCs的血管形成能力。

[關(guān)鍵詞]血管瘤;干細(xì)胞;血管生成素2;血管形成;信號通路

[中圖分類號]R732.2? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）09-0089-03

Increased Expression of Angiopoietin-2 Enhanced Angiogenesis of Hemangioma Stem Cells

ZHANG Ming-liang，WU Shan-ying，WANG Biao，LIU Zhao-liang，LEI Chen

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of Ang2 up-regulation on the Angiogenic capacity in hemangioma stem cells （HemSCs） and to reveal the role of Ang-Tie2 system in the vasculogenesis of hemangiomas. Methods? Separation and purification of HemSCs by positive selected immunomagnetic beads sorting. After being cultured and amplified in vitro， up-regulation of Ang2 by stable lentiviral transfection HemSCs. The vasculogenesis ability of HemSCs cells up-regulated by Ang2 was observed by Angiogenesis Experiment. Detect the expression changes of key protein target in cell signaling pathway by Western Blot Protein. Results? Ang2 up-regulated HemSCs angiogenesis ability was greater than the control group. Key target proteins of angiogenesis signaling pathway was enhanced in HemSCs Ang2 up-regulated. Conclusion? Ang2 up-regulation can enhance HemSCs' angiogenesis ability.

Key words： hemangioma; stem cells; angiopoietin 2（Ang2）; angiogenesis; signaling pathway

嬰幼兒血管瘤（Infantile hemangioma，IH）是一種常見的血管瘤，其獨特的生長周期是在嬰兒期6～8個月內(nèi)迅速生長，形成大量血流紊亂的血管組織，其后3～7年緩慢自發(fā)消退[1]。雖然是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，但目前對嬰幼兒血管瘤中導(dǎo)致血管異常增殖的機制知之甚少。血管系統(tǒng)的發(fā)育依賴于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，這兩個過程稱為血管生成和血管新生。在血管成熟的調(diào)節(jié)劑中，血管生成素具有特別重要的作用[2]。血管生成素（Ang）生長因子和內(nèi)皮性的Ang/Tie受體調(diào)節(jié)人體組織中的血管和淋巴管發(fā)育、血管通透性、炎癥、血管生成重塑和腫瘤血管形成[3]。

Ang/Tie信號通路由兩種酪氨酸激酶受體（Tie1，Tie2）和人體中已知的三種Tie2配體（Ang1，Ang2，Ang4）組成。Ang2結(jié)合內(nèi)皮特異性Tie2并在血管生成過程中充當(dāng)Ang1-Tie2信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，從而控制血管對外源細(xì)胞因子的反應(yīng)性[4]。Ang2通過阻斷Ang1的作用使血管不穩(wěn)定并啟動血管重塑。Ang2介導(dǎo)的血管重塑使血管對其他類型的血管生成因子敏感[5]。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使血管瘤干細(xì)胞的Ang2表達(dá)水平上調(diào)，以探究在血管瘤異常血管形成過程中Ang2所起的作用。

1? 材料和方法

1.1 血管瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)：排除經(jīng)藥物或激光治療的病例，選取筆者醫(yī)院增殖期嬰幼兒血管瘤手術(shù)標(biāo)本1例。通過患者及其家屬知情同意，且本研究已通過福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)倫理審批文書批號：閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)技審[067]號。將血管瘤組織用PBS清洗去除表面血凝塊，用小剪刀剪成1mm3大小的組織塊，加入0.2%膠原酶37℃水浴箱消化2h。以孔徑為70μm的無菌濾膜過濾，獲得單細(xì)胞懸液。每1×107個細(xì)胞加入20μl CD133免疫磁珠，充分混合后。將細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集磁珠結(jié)合的CD133+細(xì)胞;以5×105個細(xì)胞/孔接種于500ng/ml的纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24h后傳代接種。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組：根據(jù)細(xì)胞MOI及病毒滴度，干預(yù)組加入相應(yīng)病毒量（Ang2上調(diào)），陰性對照組以相同條件加入無義慢病毒（Ang2-254），空白對照組以相同條件加入等體積PBS;轉(zhuǎn)染成功后每孔加嘌呤霉素0.2mg/ml篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，穩(wěn)轉(zhuǎn)株以篩選濃度的一半濃度的嘌呤霉素維持培養(yǎng)。

1.3 血管形成實驗：將圓形比例蓋玻片置于12孔板中，將Matrigel按200μl/孔均勻包被蓋玻片，置于培養(yǎng)箱孵育30min，待凝膠成固體。將三組血管瘤干細(xì)胞（HemSCs）分別以1×105個/孔接種，加培養(yǎng)基培養(yǎng)，每8h觀察拍照，Image J軟件計算不同組中分支點及毛細(xì)管長度。

1.4 蛋白濃度測定：提取不同組細(xì)胞中的蛋白，BCA測定蛋白濃度。把蛋白樣品（20μg）上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，轉(zhuǎn)PVDF膜60min。2%的BSA室溫下孵育2h，一抗4℃孵育過夜，室溫孵育二抗2h，掃描成像，并分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 23.0軟件通過Student t檢驗或方差分析（ANOVA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并進行后期Tukey檢驗。所有值以x?±s表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 HemSCs原代分離培養(yǎng)結(jié)果：經(jīng)免疫磁珠分選后，所得細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞純度較高。接種4h后，即貼壁生長，細(xì)胞呈長梭形，見圖1。

2.2 HemSCs Ang2上調(diào)慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果：Ang2上調(diào)慢病毒轉(zhuǎn)染：在MOI 30時細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%，達(dá)最佳轉(zhuǎn)染效果;Ang2上調(diào)慢病毒顆?？煞€(wěn)定轉(zhuǎn)染HemSCs，且傳代后Ang2上調(diào)轉(zhuǎn)染特性不變。轉(zhuǎn)染后HemSCs細(xì)胞形態(tài)如圖2所示，呈長梭形，與HemSCs相比無明顯差別。

2.3 血管生成實驗結(jié)果：與血管瘤血管形成密切相關(guān)，可以反映毛細(xì)血管的官腔形成的早期過程。取不同實驗組中的HemSCs進行血管形成實驗，結(jié)果如圖3所示，干預(yù)（HemSCs Ang2上調(diào)）組血管形成的節(jié)點數(shù)及毛細(xì)管長度均顯著高于其余兩組。

2.4 Western Blot分析結(jié)果：為驗證Ang2上調(diào)后HemSCs成管能力改變的可能信號通路，檢測了影響血管生成的相關(guān)蛋白，結(jié)果如圖4～5所示：Ang2、VEGF、ERK1在Ang2上調(diào)組中表達(dá)量均顯著上調(diào)。

3? 討論

大部分的嬰幼兒血管瘤可自發(fā)向消退期轉(zhuǎn)歸，并不需要治療，但在這個過程中約有10%～15%的患者會出現(xiàn)因為腫瘤的快速生長帶來的并發(fā)癥，如：出血、潰瘍、外觀損毀、充血性心力衰竭、永久性視力損害、氣道梗阻等[6]，有時甚至危及生命。此時，為控制相關(guān)并發(fā)癥通常需要對腫瘤生長進行干預(yù)。

近年來，嬰幼兒血管瘤的治療發(fā)生了顛覆性地變化。傳統(tǒng)一線藥物糖皮質(zhì)激素，已經(jīng)迅速被口服普萘洛爾的新方法代替。相比于激素治療，普萘洛爾具有迅速有效、耐受良好和安全性高的特點。然而普萘洛爾抗嬰幼兒血管瘤的作用機制尚無定論。雖然其安全性高，但療程較長。依據(jù)最新的推薦，口服普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的持續(xù)用藥時間應(yīng)大于6個月。即便如此，也仍有10%～15%的復(fù)發(fā)率[7]。本研究以嬰幼兒血管瘤病理過程為線索，探索潛在的治療靶點及其理論依據(jù)。

Ang-Tie2系統(tǒng)是血管生成和血管完整性的重要調(diào)節(jié)劑[8]。Tie2的激活狀態(tài)是由Ang1和Ang2之間的相對平衡決定的，Ang2是體內(nèi)Ang1的天然拮抗劑，但Ang2本身的確切功能尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為高濃度的Ang2可以通過結(jié)合Ti2受體，并通過MAPK-ERK途徑，在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮其抗凋亡作用[9]。本研究證實，Ang2在干預(yù)（HemSCs Ang2上調(diào)）組中表達(dá)量顯著增加（見圖4～5），且細(xì)胞有更強的成管能力（見圖3）。

為了驗證這種成管能力的改變在HemSCs中是否通過MAPK-ERK信號通路途徑，檢測了HemSCs中MAPK-ERK通路關(guān)鍵靶蛋白ERK1。ERK1可以通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。這些作用可激活蛋白的翻譯，增強細(xì)胞的生長。在本研究中干預(yù)（HemSCs Ang2上調(diào)）組ERK1表達(dá)量皆高于其余兩組（見圖5），這也就從一方面解釋了HemSCs Ang2上調(diào)組中成管能力增強的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究證明了Ang2上調(diào)可以通過增加VEGF、ERK1、Ang2等血管生成調(diào)控蛋白的表達(dá)從而增強HemSCs的血管生成的能力，Ang-Tie2體系在血管瘤血管形成過程中起一定作用。然而各種調(diào)控蛋白之間的相互作用以及血管瘤異常血管生成的原因還需要進一步的實驗研究。

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[收稿日期]2019-12-25

本文引用格式：張明亮，吳杉英，王彪，等.血管生成素-2上調(diào)增強血管瘤干細(xì)胞血管形成能力的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（9）：89-91.