VEGF納米抗體的篩選、表達及特異性檢測

謝秋玲 羅美華 雷云 劉東晨 熊盛

(1.暨南大學 生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2.基因工程藥物國家工程研究中心，廣東 廣州 510000)

血管內皮生長因子(VEGF)是由內皮細胞產生的能誘導血管形成、增加血管通透性和促進細胞遷移的一類生長因子。研究表明，VEGF在新生血管形成和分化中起關鍵作用，F(xiàn)errara等[1-2]發(fā)現(xiàn)腫瘤的增殖與轉移、黃斑、糖尿病和高血壓引起的視網膜病變均與VEGF有關。VEGF主要通過影響血管的通透性、促進新生血管的形成從而產生致病作用，腫瘤細胞和周圍基質分泌的VEGF能刺激內皮細胞的增殖和存活，從而形成結構性異常的新生血管[3-4]。在許多人體腫瘤中，VEGF基因轉錄的信使RNA(mRNA)過度表達，其表達量與腫瘤的侵襲、轉移、預后和復發(fā)相關。因此，VEGF是公認的抗腫瘤靶點之一[5]。

近年來，單克隆抗體(mAbs)在腫瘤治療中的使用越來越廣泛，抗VEGF抗體的研究也成為熱點。在2004年，美國食品和藥物管理局(FDA)批準抗VEGF的首個單抗貝伐珠單抗上市。貝伐珠單抗是人源化單克隆抗體，可用于治療轉移性結直腸癌、非小細胞肺癌和轉移性乳腺癌[6]。隨后，F(xiàn)DA先后批準上市抗VEGF的單抗有：適用于胃癌、胃食管結合部腺癌、非小細胞肺癌、轉移性結直腸癌的雷莫蘆單抗(Cyramza)，適用于濕疹年齡相關黃斑變性的單克隆抗體片段(Fab)的雷珠單抗以及兩種抗VEGF的融合蛋白-阿柏西普和康柏西普。雖然這些抗體藥物在腫瘤治療上取得了顯著的療效，但其穩(wěn)定性、親和力、特異性和組織穿透能力仍亟待提高。

納米抗體是駱駝外周血中的一種天然無輕鏈的抗體，僅有重鏈(VHHs)和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，是能結合目的抗原的最小單位，分子質量只有常規(guī)抗體的1/10左右，僅為15 kDa；但其含有3個抗原互補決定區(qū)(CDR)，具有完整的與抗原高親和力結合的特性。與常規(guī)抗體相比，納米抗體在功能上具有獨特的性質，例如：由于納米抗體缺少常規(guī)抗體的Fc段，因此能避免產生補體反應；可以在大腸桿菌或酵母中生產，生產成本低[7]；同時具有高水溶性、高穩(wěn)定性、高抗原結合性、低免疫原性、較強的組織穿透力等優(yōu)點[8-11]。因此，納米抗體的出現(xiàn)為替代傳統(tǒng)的單抗提供了理想選擇。2017年，靶向PD-L1的納米抗體KN035被FDA批準臨床研究，次年，首個治療成人獲得性血栓性血小板紫癜(aTTP)納米抗體Caplacizumab獲得批準在歐盟上市。

本實驗以VEGF為靶點，通過免疫羊駝，構建噬菌體文庫，并從文庫中篩選到VEGF納米抗體基因VHH片段。再通過重組構建表達質粒將篩選到的基因在大腸桿菌中表達，以期獲得VEGF的納米抗體(NbVEGF)蛋白，檢測和篩選對抗原VEGF具有特異性和親和力的納米抗體，可為進一步開發(fā)檢測和治療相關疾病的抗體藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、抗原和菌株

噬菌體質粒pComb3X和表達質粒pNCS均購自Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司，E.coliDH5α和XL1-blue購自上海Novagen公司。anti-flag-HRP抗體和VEGF抗原人源化VEGFmAb購自美國Sigma公司。

1.1.2 相關試劑與儀器

TaqDNA聚合酶購自美國NEB公司，T4DNA連接酶、核酸限制性內切酶和DNA Maker均購自日本TaKaRa公司，蛋白Marker(10～170 kDa)、牛血清白蛋白(BSA)購自上海Roche公司，脫脂奶粉、酵母提取物、胰蛋白胨購自英國OXOID公司，5 mL XK16/20型Ni親和層析柱購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫羊駝

在羊駝頸部皮下分4次多點注射VEGF抗原，兩周一次，每次注射抗原250 μg。免疫前一周和末次免疫兩周后，對羊駝進行頸靜脈采血5 mL，3 500 r/min離心15 min，取上層血清于潔凈的EP管中，用VEGF抗體進行滴度檢測。對末次免疫兩周后的羊駝采血100 mL，用于分離外周血淋巴細胞;提取外周血淋巴細胞總RNA，使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit將所提取的RNA逆轉錄為cDNA。

1.2.2 VHH基因片段的擴增

引物設計：以羊駝重鏈可變區(qū)前導肽的保守序列設計上游引物，再以羊駝兩種亞型IgG鉸鏈區(qū)的特異氨基酸序列設計下游引物，序列如表1所示。PCR產物和pComb-3X載體使用SfiⅠ內切酶進行酶切后進行連接，并使用該引物驗證載體構建的正確性。

表1 VHH基因片段的擴增的引物序列Table 1 Primers for the amplification of VHH gene fragments

1.2.3 噬菌體文庫的制備和淘洗

采用電轉法將pComb-3X-VHH載體轉入大腸桿菌XL1-blue內，并加入輔助噬菌體VCSM13過夜培養(yǎng)后于4 ℃，3 000g離心15 min。將上清轉移至含有4% PEG-8 000和3% NaCl的50 mL離心管中，渦旋混勻，并于4 ℃孵育30 min，用于沉淀噬菌體。

用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)稀釋VEGF抗原至10 μg/mL，以100 μL/孔加入96孔酶標板內，于4 ℃過夜包被。拍干包被液，用0.05% PBST洗板，之后用5%脫脂牛奶封閉。將噬菌體文庫制備液加入包被有抗原的孔和陰性對照孔中，37 ℃放置2 h。

對于入庫滴度的計算，將所制備好的噬菌體文庫制備液梯度稀釋10-8倍，取1 μL感染200 μL的XL1-blue菌液，室溫孵育15 min。然后取100 μL被感染的菌液涂布于LB+Carbe平板，于37 ℃過夜培養(yǎng)。文庫大小=(克隆數×培養(yǎng)體積)/涂板體積。

1.2.4 NbVEGF在大腸桿菌中的表達

將PCR純化后的產物和經改造后的pNCS的質粒(在C端添加flag-tag和N端添加His-tag融合標簽蛋白基因)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，以T4DNA連接酶于16℃連接過夜；連接產物轉化至E.coliDH5α。提取質粒進行雙酶切鑒定，將陽性重組質粒送至生工生物工程(上海)進行測序。構建正確的重組質粒并命名為pNCS-NbVEGF。

將重組質粒轉化至E.coliDH5α，在含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的細菌基礎培養(yǎng)基(LB)平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆，接種至LB(含100 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600 nm吸光度為1.4，離心收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后采用蛋白質印跡法(Western blot)分析：將SDS-PAGE跑膠的分離膠切下，350 mA，轉膜30 min至與分離膠同等大小的硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉硝酸纖維素膜1 h，按照1：10 000稀釋比加入anti-flag-HRP抗體至硝酸纖維素膜再孵育1 h，最后滴加ECL顯色液顯色。同時重懸菌體至均質，加入1%的100 mmol 的蛋白酶抑制劑(PMSF)并混勻，冰浴超聲波破碎后離心，分別收集上清、沉淀進行SDS-PAGE檢測分析。

1.2.5 目的蛋白的純化

以鎳NTA(Ni-NTA)親和層析介質為介質裝柱，5～10倍柱床體積的1×PBS緩沖液(pH=7.4)平衡，0.45 μm過濾膜過濾后的破菌液上清上樣，90 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。SDS-PAGE蛋白電泳檢測目的蛋白的分子質量及純度。

1.2.6 ELISA檢測目的蛋白的抗原結合

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測目的蛋白的特異性，簡要步驟如下：將稀釋至0.5 μg/mL的抗原(VEGF和TNF-α、FGF-2、BSA、Milk)加入96孔酶標板中包被過夜后，加入5%的脫脂牛奶37 ℃恒溫封閉2 h后，加入300 ng/mL的NbVEGF蛋白，以VEGFmAb為陽性對照，以PBS為空白對照組，37 ℃恒溫孵育1 h后加入1 μg/mL anti-flag-HRP抗體，37 ℃孵育1 h后，加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，37 ℃避光孵育15 min。加入2.29%硫酸終止反應，最后用酶標儀檢測在405 nm和630 nm的吸光度。

2 結果分析

2.1 羊駝免疫前后血清中VEGF抗體滴度的檢測

以VEGF為抗原，分別檢測免疫前(Pre)和最終免疫后(Imn)羊駝血清中針對VEGF抗原的特異性抗體水平變化，結果如圖1所示。與免疫前相比，羊駝免疫后體內的VEGF特異性抗體滴度有所增加。說明VEGF免疫羊駝后，羊駝體內產生了一定濃度的針對VEGF抗原的特異性抗體。

圖1 羊駝免疫前后血清中VEGF抗體滴度的檢測Fig.1 Titer of antibody in llama immunized with VEGF

2.2 羊駝VHH基因的擴增

提取羊駝外周血淋巴細胞的總RNA，經過逆轉錄反應，合成cDNA，并以此為模板，根據羊駝重鏈可變區(qū)的前導肽保守序列設計上游引物F-primer，以羊駝兩種亞型IgG鉸鏈區(qū)的特異氨基酸序列設計下游引物R-primer 1和R-primer 2，采用PCR法擴增羊駝兩種亞型重鏈抗體的VHH片段，將VHH基因和噬菌體載體pComb-3X用SfiⅠ內切酶進行單酶切后進行連接，構建pComb-3X-VHH載體。pComb-3X-VHH酶切后，收集酶切產物，使用VHH的特異性引物進行PCR鑒定，結果如圖2所示。載體雙酶切大小為4 991 bp(泳道1-4)，目的基因大小約為350～400 bp(泳道5-8)，均與理論值相符，經測序后，表明質粒構建成功。

圖2 噬菌體載體pComb-3X酶切和VHH PCR驗證Fig.2 pComb-3X digestion and VHH PCR verification

2.3 噬菌體文庫的篩選

采用電轉法將pComb-3X-VHH載體轉入大腸桿菌XL1-blue內構建噬菌體文庫，并利用VEGF抗原進行淘洗。經過3輪淘洗，噬菌體的滴度得到了顯著富集(見圖3)。從第3輪淘洗的細菌平板上隨機挑取80個單克隆，經過擴增后，收集噬菌體液。以TBS作為陰性對照，用ELISA方法初步檢測噬菌體單克隆與VEGF的結合能力。當噬菌體單克隆與VEGF結合的吸光度為陰性對照吸光度3倍及以上時，可認為該噬菌體對VEGF具有高親和力，界定為陽性克隆;在該實驗中獲得了30個初步鑒定為陽性克隆。最后，經過單克隆測序獲得10個陽性抗體單克隆，分別為NbVEGF-1、NbVEGF-2、NbVEGF-3、NbVEGF-4、NbVEGF-5、NbVEGF-6、NbVEGF-7、NbVEGF-8、NbVEGF-9、NbVEGF-10。

第1輪淘洗 第2輪淘洗 第3輪淘洗圖3 噬菌體文庫的淘洗Fig.3 Panning of phage library

2.4 NbVEGF蛋白的理化性質預測

通過測序獲得了以上10個抗體的基因序列，并推導出其蛋白序列。利用軟件ExPASy對10個NbVEGF納米蛋白序列的分子質量、理論等電點(pI)和總親水性平均系數(GRAVY)進行分析。如表2所示，10個NbVEGF蛋白分子質量在20.1～20.7 kDa之間，符合納米抗體分子質量的特點；理論等電點均低于7，在5.76～6.49之間，表明NbVEGF在生理環(huán)境中帶負電荷，與VEGF發(fā)生結合反應可能是通過靜電作用實現(xiàn)的。10個NbVEGF蛋白的GRAVY值均為負值，表明NbVEGF蛋白為親水性蛋白質。

表2 NbVEGF蛋白的理化性質Table 2 Physicochemical properties of NbVEGF protein

2.5 NbVEGF納米抗體在大腸桿菌中的表達

以上10個VHH片段基因與表達質粒pNCS質粒(在C端添加Flag-tag和N端添加His-tag融合標簽蛋白基因)連接構建重組質粒。重組質粒經PCR(見圖4(a))和雙酶切(見圖4(b))鑒定，條帶大小符合預期,且測序結果與預期一致，證明質粒構建成功。

圖4 重組質粒pNCs-NbVEGF的構建Fig.4 Construction of recombinant plasmid pNCs-NbVEGF

收集表達的菌體經離心、超聲破菌后，SDS-PAGE電泳分析全菌液、上清、沉淀，NbVEGF蛋白大部分都表達在上清液中，即所有抗體都是可溶性表達，這有利于后期的蛋白純化。重組pNCS-NbVEGF表達載體轉入至E.coliDH5α培養(yǎng)后，收集菌體，超聲破碎后，離心取上清，經SDS-PAGE電泳及Western blot分析，結果表明：10個單克隆菌株均有表達，蛋白條帶大約在20 kDa，與預期的NbVEGF蛋白分子質量一致，但幾個抗體的表達量存在差異(見圖5)。

圖5 重組表達的NbVEGF的SDS-PAGE電泳及Western blot結果分析Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot result analy-sis of NbVEGF

2.6 NbVEGF蛋白的純化

將10種菌體破碎后，收集上清。因為抗體的N端連有His標簽，因此采用Ni柱親和層析進行蛋白純化。SDS-PAGE蛋白電泳如圖6所示，10個NbVEGF蛋白經親和純化后，目的蛋白得到富集，純度均大于80%。

圖6 純化后的NbVEGF蛋白Fig.6 Purified NbVEGF proteins

2.7 NbVEGF蛋白的抗原結合

以VEGF為目的抗原，血清白蛋白(BSA)、成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、牛奶(Milk)作為對照抗原，VEGFmAb為陽性對照，PBS為空白對照，采用ELISA檢測10個NbVEGF蛋白與抗原的結合能力。結果表明：在10個納米抗體蛋白中，NbVEGF-3、NbVEGF-7、NbVEGF-10均具有與VEGF抗原的結合特異性，與4個其他對照抗原特異結合能力弱或不結合，其他納米抗體蛋白則無抗原特異性。其中NbVEGF-3與VEGF抗原的結合能力最強(見圖7)，與陽性對照親和力相似。

圖7 NbVEGF蛋白的特異性Fig.7 Specificity of NbVEGF proteins

3 討論

因具有獨特的生物和生化特性，納米抗體應用前景廣闊。研究表明，納米抗體能與免疫原蛋白、酶、毒素和半抗原等多種抗原類型結合[12]，可用于蛋白質、微生物、小分子的檢測，在生物醫(yī)藥和環(huán)境監(jiān)測等多個領域可發(fā)揮作用[7]。如Qiu等[13]利用噬菌體展示技術建立了一種可以特異性檢測Cry1Ab毒素的納米抗體，該納米抗體可用于轉基因生物的分析。納米抗體也可用于甲氨蝶呤[14]和偶氮酮[15]等小分子的檢測。另一方面，納米抗體還可用于疾病治療和病原體防御。如對抗病毒，納米抗體在病毒復制中的附著、進入、脫殼各階段均能發(fā)揮作用[16]。由于納米抗體具有特異性好、良好的組織透過性以及能快速清除、副作用小的優(yōu)點，其在腫瘤治療方面具有獨特的優(yōu)勢。

腫瘤與血液供應之間的聯(lián)系最早提出在100多年前[17]，但直到1939年，人們才假設腫瘤細胞本身會釋放一種與腫瘤快速增長相關的血管生長刺激因子[18]。1989年，血管內皮生長因子A(VEGFA)的分離和克隆，是了解血管生成機制的重要一步[19-20]。近年來，研究表明胚胎血管生成、骨骼生長和軟骨形成、卵巢血管生成均與VEGF有關[21]。因此，抑制VEGF的活性是治療許多血管形成性相關疾病的關鍵，例如，Kim等[22]證明抗VEGF抗體能在裸鼠體內抑制腫瘤細胞的增殖；Paul等[23]發(fā)現(xiàn)通過抑制Src家族的活性間接抑制VEGF介導的血管通透性從而能防止野生型大鼠出現(xiàn)腦損傷。而在眼科疾病治療方面，據MARINA和ANCHOR研究數據顯示，年齡相關性黃斑變性(AMD)患者連續(xù)服用抗VEGF的雷珠單抗12個月后，可恢復7-11個字母的視力，40%以上患者可恢復15個字母的視力[24]。目前，能有效抑制VEGF活性的藥物有：VEGF抑制劑、單克隆抗體和抗體片段[25]。1993年，Kim等[22]發(fā)現(xiàn)了能靶向和中和VEGFA并抑制腫瘤生長的單克隆抗體，隨后首個人源化VEGF特異性單克隆抗體bevacizumab在2004年被美國FDA批準用于轉移性結直腸癌治療。2006年，哌加他尼和雷珠單抗獲得FDA批準治療AMD[26-27]。雖然VEGF單克隆抗體bevacizumab能對腫瘤有治療效果，但是其起效維持時間短[28]，且其在實體組織的穿透率低，分布不對稱，導致臨床上靶向腫瘤不恰當[29]；此外，bevacizumab會引起很多不良反應，在早期對多種癌癥類型使用bevacizumab的研究建立了一組由抗血管生成治療引起的不良事件(AEs)，其中記載的毒性最大的是高血壓，在患者中占比高達36%[30]。另外，其他患者出現(xiàn)蛋白尿、直腸出血和淚目障礙等副作用[31-32]。與常規(guī)的抗體相比，納米抗體具有體積小，高親和力等優(yōu)點，是作為抗VEGF研究的理想材料；但迄今為止，抗VEGF的納米抗體仍未問世。因此，抗VEGF的納米抗體的研究具有十分重要的意義。

4 結語

通過用VEGF免疫羊駝，抽取外周血構建了VEGF的納米抗體噬菌體庫，并篩選獲得10株與VEGF有親和力的VHH片段基因。進一步在大腸桿菌中重組表達該10個納米抗體獲得VEGF納米抗體蛋白，經理化性質預測和實驗驗證了其與VEGF特異性的親和，獲得了3個具有VEGF結合特異性的納米抗體，其中1個具有較高的抗原親和力。這為將來進一步進行VEGF納米抗體的研發(fā)奠定了基礎。接下來應進一步地探究這3個納米抗體NbVEGF的穩(wěn)定性和對血管形成的抑制作用等生物活性，以及更深入地研究納米抗體的腫瘤治療及眼內新生血管綜合癥和腦水腫等疾病的療效。