中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌H2的培養(yǎng)及益生特性評價

劉冬梅 胡金雙 黃泳堯 黃燕燕

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

相對于歐美國家，發(fā)酵乳制品在中國起步雖晚，但發(fā)展迅速，產(chǎn)量逐年大幅增加[1]。然而進(jìn)口發(fā)酵劑幾乎占據(jù)了我國發(fā)酵劑市場的全部份額[2]，發(fā)酵劑的長期受制于人會限制我國乳品業(yè)的發(fā)展速度。研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵劑是促進(jìn)我國乳業(yè)發(fā)展的重要途徑之一，而篩選源于中國本土傳統(tǒng)發(fā)酵制品的新菌株，并對其潛在特性進(jìn)行研究是研發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)發(fā)酵劑的基礎(chǔ)。

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是僅次于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的第二大工業(yè)乳酸菌菌種[3]，是乳品發(fā)酵劑的主要菌株之一。其產(chǎn)酸[4]、產(chǎn)胞外多糖[5]、產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)[6-7]等性能直接關(guān)系到發(fā)酵乳的品質(zhì)。其產(chǎn)生的乳酸可以賦予發(fā)酵乳酸爽的口感，同時可提高產(chǎn)品的保藏性能，促進(jìn)人體的胃腸蠕動，促進(jìn)蛋白、礦物質(zhì)等的消化吸收[8]。在實際生產(chǎn)中，球菌的繁殖能力相對弱于桿菌，隨著傳代次數(shù)的增加，球菌的占比會逐漸減小[9]，因此優(yōu)化得到適宜嗜熱鏈球菌生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是發(fā)酵劑制備的重要內(nèi)容之一。

嗜熱鏈球菌是具有益生性質(zhì)的發(fā)酵劑菌株，其益生性質(zhì)可使發(fā)酵乳制品具有功能性，滿足消費者“綠色、健康、功能性”的追求。研究表明，嗜熱鏈球菌能夠合成多種維生素，如葉酸等[10]；刺激機體的免疫系統(tǒng)，提高機體抗病能力[11]；抑制或清除病原菌產(chǎn)生的毒素，凈化腸道環(huán)境[12]；產(chǎn)生乳糖酶，有效緩解乳糖不耐癥[13]。此外，乳酸菌胞內(nèi)存在多種與抗氧化有關(guān)的酶系和活性物質(zhì)，可用于功能性食品或天然抗氧化添加劑的研發(fā)與生產(chǎn)[14]。

本研究從中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳——內(nèi)蒙古家庭自制酸奶中篩選得到了一株嗜熱鏈球菌H2(簡稱H2)，對其增殖培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時對其體外益生性質(zhì)做了初步探究，為該菌用于發(fā)酵具有益生價值的產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

實驗樣品為內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市的家庭自制酸奶。

1.1.2 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L、四水硫酸錳0.05 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐溫-80 1 g/L、pH=6.4±0.2.

丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、蛋氨酸、酪氨酸購自BBI生命科學(xué)有限公司；其余試劑購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F型超凈工作臺購自上海博訊實業(yè)有限公司；HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自寧波東南儀器有限公司；生物顯微鏡購自鳳凰光學(xué)股份有限公司；JW-3021HR型高速冷凍離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；FE20 Plus pH計購自梅特勒-托利多儀器有限公司；多功能微孔板檢測儀購自美國BioTek公司；高效液相色譜儀購自美國賽默飛世爾公司；冷場發(fā)射掃描電鏡Regulus 8100購自日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離與鑒定

采用梯度稀釋平板涂布法，從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市的家庭自制酸奶樣品中分離得到一特征菌落H2，反復(fù)劃線純化至無雜菌后甘油管保存。

參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第9版)[15]對H2進(jìn)行生理生化鑒定，使用電子顯微鏡和冷場掃描電鏡觀察形態(tài)，參照閆穎娟等[16]的方法制備掃描電鏡樣品。將菌株H2送至廣州基迪奧生物科技有限公司測序，用MEGA 5.2軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建分析。

1.3.2 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

根據(jù)前期實驗結(jié)果，H2生長最適氮源為酵母提取物、最適生長因子為半胱氨酸、最適緩沖鹽體系補充物為碳酸鈣。分別測定不同濃度的酵母提取物、半胱氨酸、碳酸鈣對嗜熱鏈球菌H2生長的影響，確定各因素的最佳范圍。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以酵母提取物、半胱氨酸和碳酸鈣為影響因素，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken試驗，得到各組分的最佳濃度。

1.3.3 最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件測定

其他條件不變，分別測定不同初始培養(yǎng)pH、接種量以及培養(yǎng)溫度對H2菌體密度的影響，確定最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件。

1.3.4 耐酸、膽鹽和人工胃腸液能力測定

將活化后的H2按2%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種于pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的MRS培養(yǎng)基中，測定初始活菌數(shù)A0和37 ℃培養(yǎng)3 h后的活菌數(shù)A1。將H2分別接種于含有膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的MRS培養(yǎng)基中，測定初始活菌數(shù)A0和37 ℃培養(yǎng)3 h后的活菌數(shù)A2。

參照Tarrah等[17]的方法配制人工胃液，接種H2，初始活菌數(shù)為A0。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h后測定活菌數(shù)A3。將上述人工胃液調(diào)節(jié)為人工腸液，繼續(xù)培養(yǎng)2、4 h后測定活菌數(shù)A4、A5。存活率R的計算公式如下：

1.3.5 抗氧化能力測定

自由基清除能力是常用的抗氧化性能評價指標(biāo)，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、·OH、O2-的清除能力等[14]。研究表明，乳酸菌在發(fā)酵過程中的不同組分均可具有抗氧化活性[18]，且發(fā)酵上清液的自由基清除能力遠(yuǎn)高于菌體和胞內(nèi)提取物[19]。參考蔣雨鶴等[20]的方法制備H2發(fā)酵上清液和細(xì)胞破碎液，分別測定兩組分的DPPH、·OH和O2-清除率。

1.3.6 產(chǎn)酸能力測定

將過夜培養(yǎng)的H2菌液于4 ℃、6 000 r/min離心15 min,收集上清液，經(jīng)0.22 μm微膜過濾得到發(fā)酵上清液。使用高效液相色譜(HPLC)測定H2發(fā)酵上清液中酸的種類和含量。所用標(biāo)準(zhǔn)品為1.00、1.25、1.67、2.50、5.00、10.00 mmol/L的甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和6.68、8.35、11.14、16.71、33.41、66.83 mmol/L的乳酸(L-乳酸和D-乳酸)標(biāo)準(zhǔn)溶液。參考周全興[21]的測定方法，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(mmol/L)，有機酸峰面積(mAU·min)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Deisgn Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計及分析，SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 9.1軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株H2的鑒定與電鏡分析

菌株H2為革蘭氏陽性菌，菌體呈卵圓形，成對存在或形成長鏈，如圖1所示。KOH試驗陰性，過氧化氫酶試驗陰性，明膠液化試驗陰性，可利用葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生有機酸。

圖1 H2的光學(xué)顯微鏡圖(×1 600)和掃描電鏡圖(×50 000)Fig.1 Optical micrographs(×1 600)and scanning electron pictures (×50 000)of H2 microscope

將H2的16S rDNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示其與StreptococcusthermophilusTSGB1184的相似度大于99%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。綜合其菌體形態(tài)、生理生化及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，可將H2鑒定為嗜熱鏈球菌。

圖2 H2的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of H2

2.2 菌株H2培養(yǎng)基配方的響應(yīng)面法優(yōu)化

酵母提取物不僅能提供微生物生長所需氮源，還含有多種維生素、核苷酸和微量元素等，可顯著促進(jìn)乳酸菌的生長[22]。李康寧等[23]的實驗表明，酵母提取物和半胱氨酸均是影響嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的顯著因子。碳酸鈣是常用的發(fā)酵中和劑，可使菌體達(dá)到更高的密度[24]。由圖3可知，促進(jìn)H2生長的酵母提取物的最適質(zhì)量濃度為45.0 g/L，半胱氨酸的最適質(zhì)量濃度為169.5 mg/L，碳酸鈣的最適質(zhì)量濃度為0.7 g/L。圖3中,D(600)表示H2菌液在600 nm波長處的吸光值，Y表示H2的活菌數(shù)。響應(yīng)面試驗設(shè)計的因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計的因素和水平Table 1 Variables and their levels in Box-Behnken design

(a)酵母提取物添加量對H2菌體密度的影響

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken test results

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

酵母提取物、半胱氨酸、碳酸鈣的響應(yīng)面和等高線如圖4所示。隨著酵母提取物與半胱氨酸含量的增加，H2活菌數(shù)先增加后降低，等高線呈橢圓形，兩者的交互作用對活菌數(shù)的影響顯著(P<0.05)。同理，酵母提取物與碳酸鈣的交互作用、碳酸鈣與半胱氨酸的交互作用也對H2活菌數(shù)有顯著影響(P<0.05)。

(a)酵母提取物與半胱氨酸的響應(yīng)面圖

模型得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方為酵母提取物添加量45.25 g/L、半胱氨酸添加量169.5 mg/L、碳酸鈣添加量0.705 g/L，理論活菌數(shù)為1.96×109CFU/mL，實驗驗證活菌數(shù)為1.93×109CFU/mL，預(yù)測值與實際值接近，說明該預(yù)測參數(shù)可靠。

2.3 菌株H2的最適培養(yǎng)條件控制

圖5(a)表明，隨著初始pH的增加，H2的菌體密度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其中初始pH值為5.5時菌體密度最大.由圖5(b)可知，接種量增加可提高H2的菌體密度，但接種量為3.5%、4.0%和4.5%時菌體密度無顯著差異(P>0.05)，選擇3.5%作為最佳接種量。圖5(c)表明，溫度為40℃時，H2菌體密度顯著高于其他溫度。該結(jié)果與陳琳等[25]報道的嗜熱鏈球菌WHH 003的最佳培養(yǎng)條件(pH 5.5、溫度45℃、接種量4%)相近，但H2的最適溫度和接種量均低于WHH 003，可節(jié)省控溫消耗的能量，節(jié)省種子量。

(a)不同初始培養(yǎng)pH對H2菌體密度的影響

綜上，優(yōu)化后的H2培養(yǎng)基為酵母提取物添加量45.25 g/L,半胱氨酸添加量169.5 mg/L,碳酸鈣添加量0.705 g/L;最適培養(yǎng)溫度40 ℃,初始pH值5.5，種子液添加量3.5%。培養(yǎng)條件優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)4.20×109CFU/mL，是優(yōu)化前的37.8倍。

2.4 菌株H2益生特性的體外評價

作為益生菌，耐受人體消化道環(huán)境是其發(fā)揮益生性能的前提[26-27]。大多嗜熱鏈球菌對pH 3以下、膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%以上敏感[28]。由表4可知，H2在pH值為5和6時存活率大于100%，從pH 4開始，隨著pH值的降低菌株的存活率降低，在pH 3時，3 h后存活率為49.65%。隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,H2的存活率減小，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時，3 h后H2的存活率為99.62%。

表4 H2在不同pH值和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的存活率Table 4 Survival rate of H2 at different pH and bile salt concentration

實驗結(jié)果表明：經(jīng)人工胃液1 h后，H2的存活率為88.68%，降低值小于1個數(shù)量級，說明H2對人工胃液的耐受性良好；進(jìn)入人工腸液2 h后的存活率為86.86%，4 h后的存活率為82.04%。Tarrah等[17]使用相似方法測定了多株嗜熱鏈球菌對人工胃腸液的耐受性，H2的存活率與其最優(yōu)菌株MTH17CL396、M17PTZA496、TH982等相近。

如表5所示，H2的發(fā)酵上清液和細(xì)胞破碎液對3種氧化自由基均有清除作用。其中H2上清液對DPPH的清除率最高，為94.06%，遠(yuǎn)高于王玥[29]報道的42株嗜熱鏈球菌對DPPH自由基的清除平均值34.45%。

表5 H2對DPPH、·OH和O2-的清除率Table 5 Scavenging activities of H2 on DPPH，·OH and O2- %

L-乳酸可被人體代謝，促進(jìn)人體的胃腸蠕動和蛋白、礦物質(zhì)等的消化吸收[30]，而D-乳酸則會在體內(nèi)堆積，危害健康[31]。由圖6和圖7可知，在嗜熱鏈球菌H2的發(fā)酵液中可檢測到L-乳酸而無D-乳酸，說明H2所產(chǎn)乳酸安全。此外還可檢測到甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸。各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及H2發(fā)酵上清液中各酸含量如表6所示，其中L-乳酸濃度最大為12.64 mmol/L。表中，x代表峰面積，y表示濃度。

1-9分別為D-乳酸、L-乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸圖6 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of standard sample

圖7 H2發(fā)酵上清液的色譜圖Fig.7 Chromatogram of H2 fermentation supernatant

表6 各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及H2發(fā)酵上清液中各酸含量

3 結(jié)語

H2是源于內(nèi)蒙傳統(tǒng)發(fā)酵乳的一株嗜熱鏈球菌，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化和培養(yǎng)條件控制后活菌數(shù)可達(dá)4.20×109CFU/mL；其可耐受酸、膽鹽和人工胃腸液，符合益生菌耐受人體消化道環(huán)境的初步標(biāo)準(zhǔn)；其可產(chǎn)生L-乳酸及各種短鏈脂肪酸，且發(fā)酵上清具有抗氧化能力，具有一定的益生性能。本研究為其日后進(jìn)行菌粉制備和功能性食品生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。