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    脂多糖對(duì)河南華溪蟹免疫能力的調(diào)節(jié)作用

    2020-10-30 01:54:02周妍英王蘭
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2020年16期
    關(guān)鍵詞:免疫能力

    周妍英 王蘭

    摘要:以河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)血淋巴細(xì)胞為材料,不同濃度脂多糖(1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL)分別刺激溪蟹12h、24h后,收集各處理組溪蟹血淋巴細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定酸性磷酸酶(ac-id phosphatase , ACP )、 堿性鱗酸酶(alkaline phosphatase , AKP) 和 溶菌酶(lysozyme , LSZ) 等溶酶體酶的活性及酚氧化酶(Phenoloxidase,P0)的活性;采用中性紅染色法測(cè)定溶酶體膜的穩(wěn)定性;采用實(shí)時(shí)焚光定量PCR法檢測(cè)紛氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、溶菌酶2個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,注射脂多糖后,溪蟹血淋巴細(xì)胞酸性磷酸酶、堿性嶙酸酶、溶菌酶活性和酚氧化酶活性均有所升高;溶酶體酶膜穩(wěn)定性下降;在脂多糖注射24h后,酚氧化酶原和溶菌酶mRNA表達(dá)水平均有顯著上調(diào)。可見(jiàn),脂多糖可以誘導(dǎo)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性下降并且釋放其中的溶酶體酶,免疫相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào),在一定程度上對(duì)溪蟹免疫能力有增強(qiáng)效果。

    關(guān)鍵詞:免疫能力;脂多糖;河南華溪蟹

    中圖分類(lèi)號(hào) S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2020)16-0128-05

    隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和新陳代謝等急劇變化的應(yīng)激條件容易對(duì)各類(lèi)水生動(dòng)物造成疾病,甚至死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以往使用各種抗生素來(lái)防治水生動(dòng)物養(yǎng)殖病害,其負(fù)面影響較為嚴(yán)重,我國(guó)相關(guān)部門(mén)已逐步限制其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用。近年來(lái),對(duì)水生動(dòng)物尤其是蟹類(lèi)免疫機(jī)理的深入探索和認(rèn)識(shí),加上對(duì)免疫增強(qiáng)劑的研究,為水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治開(kāi)辟了一條新的思路[1]。為了防控水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的病害,國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者開(kāi)始將關(guān)注點(diǎn)投向了免疫增強(qiáng)劑。目前發(fā)現(xiàn),多種化合物已經(jīng)作為免疫增強(qiáng)劑投入到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。

    目前發(fā)現(xiàn),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,不僅可以引起機(jī)體體液免疫應(yīng)答,也可以提高機(jī)體的非特異性免疫功能,有效增強(qiáng)蝦蟹類(lèi)、魚(yú)類(lèi)免疫能力[4-7],效果明顯,已被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)研究。研究表明,脂多糖可以分別激活凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[5]、中華絨螯蟹(Eriocheir si-nensis)[6]酚氧化酶原系統(tǒng)釋放酚氧化酶(Phenoloxidase,PO),進(jìn)而將酚氧化成醌,最終形成黑色素,黑色素能夠使外來(lái)病菌和宿主隔離,從而達(dá)到免疫效果。還有文獻(xiàn)表明,脂多糖刺激鋸緣青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)酶活性升高[7],血細(xì)胞吞噬功能也增強(qiáng)。脂多糖作為飼料添加劑可以增加黑虎蝦(Alpheus bellulus)的存活率,誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)[8]。王玉芬等[9]研究指出,竹筍多糖能增強(qiáng)中華絨螯蟹(Eriocheir si-nensis)的非特異性免疫反應(yīng),可添加在中華絨螯蟹詞料里來(lái)提高其免疫功能。趙紫越等[10]報(bào)道,黃芪多糖可以誘導(dǎo)中華絨螯蟹血細(xì)胞中的抗脂多糖因子、抗菌肽、酚氧化酶和Toll樣受體基因表達(dá)水平普遍上調(diào),提高了蟹體免疫能力。此外,大黃多糖刺激擬穴青蟹(Scyllparamamo-sain)后,血清中非特異性免疫指標(biāo)活性均顯著提高[11]。

    甲殼動(dòng)物缺乏免疫球蛋白,其體液免疫主要是一些非特異性的酶或其他免疫因子來(lái)共同完成的。據(jù)報(bào)道,甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞主要分為顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞兩大類(lèi),體液免疫因子酚氧化酶一般以酶原的形式即存在于顆粒細(xì)胞中[12,13]。當(dāng)血細(xì)胞脫顆粒時(shí),將酚氧化酶原釋放到胞外,被激活轉(zhuǎn)變成有活性的酚氧化酶。還有研究報(bào)道,溶酶體是甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞中重要的亞細(xì)胞器。在一些外來(lái)物的刺激作用下,溶酶體酶的膜很容易破裂而釋放出其中的水解酶(酸性磷酸酶(acid phospha-tase,ACP )、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ,AKP) 和溶菌酶(lysozyme,LSZ)等),進(jìn)一步發(fā)揮免疫作用[14]。本研究以河南華溪蟹(Sinopotamon henaneme)血淋巴細(xì)胞為試驗(yàn)材料,用脂多糖作為免疫刺激劑,研究其對(duì)溪蟹免疫相關(guān)酶(酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶)活性、溶酶體膜的穩(wěn)定性、溶菌酶和酚氧化酶原基因mRN-NA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用,探索脂多糖對(duì)溪蟹免疫功能的影響,以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 河南華溪蟹購(gòu)自太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。采用曝氣自來(lái)水,于循環(huán)系統(tǒng)的水族缸中暫養(yǎng)兩周以上,溫度為15~18℃,連續(xù)充氣,養(yǎng)殖密度為4~5只/L,每2d喂食1次。

    1.1.2 主要試劑 脂多糖(E. Coli,055: B5,L2880,Sig-ma);中性紅(Sigma);乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純;四種酶的活性及蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所??俁NA提取試劑盒(RNA isoPlus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒PremkTaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)均為T(mén)akara試劑盒。ProO、LSZ和內(nèi)參基因β-actin的引物均由上海生工有限公司合成。

    1.1.3 主要儀器 超低溫冰箱(Thermo Forma,美國(guó));冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5804R,德國(guó));多功能酶標(biāo)儀(Spec-tra max,M5,美國(guó))。普通PCR儀(Eppendorf Mastercyclergradient,德國(guó))、凝膠成像系統(tǒng)(Alpha FluorChem HD2,美國(guó))、微量分光光度計(jì)(Eppendorf,Hamburg,德國(guó))和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500,美國(guó))。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 暫養(yǎng)結(jié)束后,隨機(jī)選取健康活潑和個(gè)體大小一致(平均濕重為20.0±0.5g)的,附肢完整的溪蟹個(gè)體,分成5組,每組10只個(gè)體。設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組(無(wú)菌生理鹽水)和4個(gè)脂多糖作用組,濃度分別是1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL,刺激12h、24h,取血淋巴進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 樣品制備 將每組溪蟹個(gè)體分別置于冰上,用無(wú)菌注射器從溪蟹第4步足基部抽取血淋巴,將所取得的血液與等體積的抗凝劑同時(shí)裝入離心管混勻,離心棄上清,制成106的細(xì)胞懸液,0.5mL的樣品經(jīng)液氮速凍,以備提取RNA用;一部分用于溶酶體膜穩(wěn)定性的測(cè)定;剩余的樣品-80℃保存,待用。

    1.2.3 溶酶體膜的穩(wěn)定性將20μL的血細(xì)胞懸浮液放入離心管中,每管加入40μL的中性紅溶液(用TBS緩沖液配制成0.33%的液體),在10℃孵育2h,200g離心5min,用TBS緩沖液洗滌;加入200μL的混合液(1%冰醋酸:50%乙醇=1:1)混勻后,孵育。在多功能酶標(biāo)儀上,測(cè)定其吸光值,結(jié)果用O.D./mg/mL蛋白來(lái)表示。

    1.2.4 酶活性測(cè)定 ACP、AKP、LSZ和P0活性均依據(jù)南京建成試劑盒中說(shuō)明書(shū)中的方法來(lái)測(cè)定。

    1.2.5 proPO,LSZ mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)以所有處理組合成的cDNA為模板,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量試驗(yàn)。每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)結(jié)果由公式2-△△Ct計(jì)算出基因的表達(dá)量。試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

    1.3 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0中的AN0VA法對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,其中P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。用軟件Origin 10.0作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性的影響 由圖1可知,脂多糖刺激溪蟹12h,血淋巴細(xì)胞溶酶體膜的穩(wěn)定性有所下降,其中,當(dāng)脂多糖濃度是4.0μg/mL時(shí),溶酶體膜的穩(wěn)定性較對(duì)照組相比顯著下降。脂多糖刺激溪蟹24h,脂多糖濃度分別是4.0和8.0μg/mL時(shí),與對(duì)照組相比,血淋巴細(xì)胞溶酶體膜的穩(wěn)定性極顯著下降(P<0.01)。

    2.3 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞酚氧化酶原基因表達(dá)水平的影響 由圖3可知,脂多糖刺激溪蟹后,血淋巴細(xì)胞中酚氧化酶原基因表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在脂多糖(2.0、4.0和8.0μg/mL)作用12h時(shí),酚氧化酶原

    2.2 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞ACP、AKP、LZM及PO活性的影響 由圖2可知,溪蟹血淋巴細(xì)胞中酸性磷酸酶活性隨著脂多糖注射濃度增加而逐漸升高,在脂多糖為4.0和8.0μg/mL時(shí),酸性磷酸酶活性顯著升高。堿性磷酸酶活性和溶菌酶活性變化與酸性磷酸酶活性變化趨勢(shì)大體上一致(圖2B、2C)。當(dāng)脂多糖注射時(shí)間延長(zhǎng)至24h,除低濃度組(1.Oμg/mL)外,其他脂多糖濃度組作用下,堿性磷酸酶活性出現(xiàn)了極顯著升高(P<0.01)。溶菌酶活性在較高濃度的脂多糖(4.0和8.0μg/mL)作用時(shí),也出現(xiàn)了顯著升高現(xiàn)象(P<0.05或者P<0.01)。從圖2D看出,隨著脂多糖作用時(shí)間延長(zhǎng),酚氧化酶活性一直升高。當(dāng)脂多糖濃度是4.0μg/mL時(shí),其活性達(dá)到峰值,在較高濃度8.0μg/mL時(shí),酚氧化酶活性有所下降?;虮磉_(dá)水平分別是對(duì)照組的3.6、5.5、5.6倍。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至24h,酚氧化酶原基因表達(dá)水平一直升高,在較高濃度時(shí),其表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照組的8.6倍。

    2.4 脂多糖對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶菌酶基因表達(dá)水平的影響 由圖4可知,在脂多糖(2.0和8.0μg/mL)作用12h時(shí),溶菌酶基因表達(dá)水平分別是對(duì)照組的3.3和5.5倍(P<0.01)。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至24h,溶菌酶基因表達(dá)水平一直升高,在較高濃度(8.0μg/mL)時(shí),其表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照組的6.7倍。注射脂多糖后,溪蟹血淋巴細(xì)胞中溶菌酶基因表達(dá)水平整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

    3 討論

    甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)能主要依賴非特異性免疫,由血淋巴細(xì)胞或者從血淋巴細(xì)胞釋放出來(lái)的免疫因子來(lái)共同完成。其中,血淋巴細(xì)胞中的亞細(xì)胞器溶酶體在免疫識(shí)別和防御中起著重要作用。溶菌酶是甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的重要成分,能夠水解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的多糖,并使之水解釋放出來(lái),形成水解酶體系,破壞和消除入侵外來(lái)物。酸性磷酸酶是動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶[15],也是甲殼動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分,它可以通過(guò)水解表面帶有磷酸酯的異物而破壞異物。堿性磷酸酶活性的提高,可以加速相應(yīng)組織的物質(zhì)代謝,為機(jī)體提供所需的無(wú)機(jī)磷,積累更多的能量。楊季芳等人報(bào)道,從南極海洋寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌提取的脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性[16],免疫增強(qiáng)效果較好。同樣,本研究結(jié)果顯示,微量的脂多糖可以引起河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性下降,溶酶體酶(酸性磷酸酶和堿性磷酸酶)活性升高,這與謝鵬關(guān)于脂多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的研究結(jié)果也類(lèi)似[17]。文英等研究發(fā)現(xiàn),大黃多糖刺激擬穴青蟹后,血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶和溶菌酶等非特異性免疫指標(biāo)活性均顯著提高[11],與本研究結(jié)果一致。

    據(jù)報(bào)道,脂多糖可以刺激甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞脫顆粒釋放免疫因子如酚氧化酶來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[18]。甲殼動(dòng)物體內(nèi)酚氧化酶激活系統(tǒng)在免疫識(shí)別和防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,該系統(tǒng)以非活化狀態(tài)存在于顆粒細(xì)胞中,脂多糖可引起細(xì)胞胞吐作用,激活酚氧化酶原系統(tǒng),伴隨著大量免疫活性因子的產(chǎn)生,通過(guò)多條途徑參與免疫作用。Soderhall等曾報(bào)道了脂多糖可以促使機(jī)體產(chǎn)生一種激活蛋白酶,從而使無(wú)活性的酚氧化酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酚氧化酶[19]。研究發(fā)現(xiàn),大黃多糖刺激擬穴青蟹4d后,血細(xì)胞中的酚氧化酶原基因表達(dá)水平上調(diào)至對(duì)照組的2.1倍,酚氧化酶活性也顯著升高[11]。潘清清[20]。證實(shí)大黃多糖可顯著提高鋸緣青蟹血淋巴酚氧化酶活力,這與本論文中脂多糖刺激河南華溪蟹后,血淋巴細(xì)胞中酚氧化酶原表達(dá)水平上調(diào),酚氧化酶活性也增加的結(jié)果相似。脂多糖可以通過(guò)改變梭子蟹血清中的溶菌酶活力及血細(xì)胞吞噬活性來(lái)提高梭子蟹的非特異性免疫功能[21]。還有研究報(bào)道,脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)血清中溶菌酶活力[16]。尼羅羅非魚(yú)(Ore-chromis niloticus)在脂多糖刺激后,參與其非特異性免疫的結(jié)構(gòu)域接合子蛋白(TIRAP)基因表達(dá)上調(diào)[22]。本研究結(jié)果表明,注射脂多糖后,河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞中的溶菌酶基因表達(dá)水平上調(diào),伴隨著溶菌酶活力也升高,這與上述報(bào)道結(jié)果是相同的。

    綜上所述,脂多糖可以通過(guò)改變河南華溪蟹血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力及免疫相關(guān)酶基因表達(dá)來(lái)提高溪蟹的非特異性免疫功能,但是否影響溪蟹血淋巴細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu),是否對(duì)非特異性免疫其他相關(guān)因子有影響,以及通過(guò)什么途徑來(lái)提高溪蟹免疫能力,還有待進(jìn)一步研究。

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    (責(zé)編:張宏民)

    基金項(xiàng)目:山西省高等學(xué)??萍紕?chuàng)新項(xiàng)目(2019L0844);忻州師范學(xué)院科研基金項(xiàng)目(2018KY20)。

    作者簡(jiǎn)介:周妍英(1984-,女,山西人,博士,講師,研究方向:重金屬污染對(duì)水生動(dòng)物毒性效應(yīng)。 *通訊作者 收稿日期:2020-06-30

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