高效液相色譜法測定甘氨酰-D-谷氨酰胺的方法學(xué)建立與驗(yàn)證

楊萬運(yùn)，肖海榮，孫國琳，潘瀟

（山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東威海 264200）

高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）為常用分離和檢測手段，在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用[1]，具有速度快、效率高、靈敏度高、自動(dòng)化和適用性廣等特點(diǎn)[2]，有著廣泛的應(yīng)用前景。

構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸都是L型氨基酸，甘氨酰-L-谷氨酰胺常被用于提供谷氨酰胺以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。而經(jīng)由化學(xué)合成得到的藥物往往是對映體，不是單一的光學(xué)異構(gòu)體。對于甘氨酰谷氨酰胺的一對對映體，甘氨酰-L-谷氨酰胺具有藥理活性，而甘氨酰-D-谷氨酰胺則沒有顯著的藥理作用。為了保證合成產(chǎn)物的光學(xué)純度，嚴(yán)格控制合成過程中甘氨酰-D-谷氨酰胺的產(chǎn)生是一個(gè)十分重要的工作。

研制具有不對稱中心藥物時(shí)，需要用到多種手性色譜柱和手性流動(dòng)相來進(jìn)行測試，其測試時(shí)間長，效果不理想。甘氨酰谷氨酰胺為末端吸收，紫外吸收不強(qiáng)，采用手性色譜柱進(jìn)行分離測定甘氨酰-D-谷氨酰胺不但成本高，而且分離難度大。目前有專利[3]采用衍生化原理對甘氨酰-D-谷氨酰胺進(jìn)行分離檢測的報(bào)道，但是其方法需要的反應(yīng)時(shí)間長，還需要溶劑干燥、復(fù)溶、過濾等步驟，操作步驟煩瑣。

因此，研發(fā)一種快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用范圍廣的甘氨酰-D-谷氨酰胺的高效液相檢測方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問題。本文提供了一種簡便、高效地檢測甘氨酰-D-谷氨酰胺的高效液相方法，并對其可行性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司。甲酸，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二乙胺，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品、甘氨酰谷氨酰胺，威高藥業(yè)股份有限公司；Waters AccQ·Fluor試劑盒，包括 Waters AccQ·Fluor硼酸緩沖液（Buffer1），Waters AccQ·Fluor衍生劑粉末（2A） 和Waters AccQ·Fluor衍生劑稀釋劑（2B），美國Waters公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 色譜條件

用硅膠表面共價(jià)鍵合-奎寧（8R,9S）-（1R,2R）-環(huán)己基氨基磺酸衍生物為填充劑（0.40 cm×15 cm，3 μm）；以甲酸-二乙胺-甲醇（1.9∶2.6∶995.5）為流動(dòng)相，柱溫為20 ℃，檢測波長為248 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

（1）衍生試劑的制備

由2B瓶中吸取稀釋劑1 mL至2A瓶中，加蓋密封，震蕩10 s，于55 ℃加熱30 min，使衍生劑粉末全部溶解，取出放冷后，于干燥器內(nèi)存放。

（2）供試品溶液的制備

取甘氨酰-L-谷氨酰胺適量，精密稱定，加超純水溶解制成濃度3 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

（3）甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品貯備溶液

取甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品22.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻；量取5 mL，置50 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（4）甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品溶液

精密量取甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品貯備液2 mL，置20 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（5）測試溶液的制備

取甘氨酰谷氨酰胺約60 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，精密加入甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品貯備液2 mL，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（6）溶液衍生制備

精密量取待測溶液10 μL，置干燥的衍生管（直徑6 mm，高50 mm）中，加入緩沖液（Buffer1）30 μL，渦旋混和，加入衍生試劑60 μL，渦旋混和15 s，樣品管用石蠟?zāi)し饪?，?5 ℃加熱10 min，取出放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至微量進(jìn)樣管中，即得。

1.3.2 測定方法

精密量取供試品溶液10 μL，置干燥的衍生管（直徑6 mm，高50 mm）中，加入緩沖液（Buffer1）30 μL，渦旋混合，加入衍生試劑60 μL，渦旋混合15 s，樣品管用石蠟?zāi)し饪?，?5 ℃加熱10 min，取出放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至微量進(jìn)樣管中，精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至60 min；另精密量取混合對照品溶液10 μL，同法衍生操作并測定。

1.4 方法驗(yàn)證

1.4.1 專屬性試驗(yàn)

制備對照品溶液、供試品溶液和測試溶液。精密量取2 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

配制并衍生測試溶液。精密量取2 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。

1.4.3 線性范圍試驗(yàn)

取甘氨酰-D-谷氨酰胺適量，精密稱定，置量瓶中，加超純水制成濃度約為45 μg/mL的溶液。量取該溶液適量，加超純水依次稀釋，分別制成0.450 μg/mL、2.250 μg/mL、3.600 μg/mL、4.500 μg/mL、5.400 μg/mL、6.750 μg/mL的線性溶液。分別精密量取10 μL，按照“專屬性”項(xiàng)下方法衍生。分別精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.4.4 靈敏度試驗(yàn)

（1）檢測限試驗(yàn)。精密量取定量限溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μL，按“專屬性”項(xiàng)下方法衍生得相應(yīng)溶液，精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

（2）定量限試驗(yàn)。精密稱取甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品適量，加超純水溶解并逐步稀釋，精密量取10 μL，按“專屬性”項(xiàng)下方法衍生得相應(yīng)溶液，精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.4.5 精密度試驗(yàn)

（1）重復(fù)性試驗(yàn)。配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品溶液和6份測試溶液。分別精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

（2）中間精密度試驗(yàn)。由不同試驗(yàn)人員配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品溶液和6份測試溶液。使用不同試驗(yàn)儀器于不同試驗(yàn)日期進(jìn)行試驗(yàn)，平行測定6份測試溶液，將6份測試溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺測得含量與精密度試驗(yàn)中所測得結(jié)果進(jìn)行比較，考察本方法中間精密度。

1.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品約22.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

取本品約60 mg，精密稱定，分別置20 mL量瓶中，各加入甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品貯備液1.6 mL，2.0 mL，2.4 mL，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得相應(yīng)的80%、100%、120%的樣品加樣回收率溶液。

每個(gè)濃度的溶液各配制3份。分別精密量取上述溶液各10 μL，按“專屬性”項(xiàng)下方法衍生得相應(yīng)溶液，精密量取2 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算甘氨酰-D-谷氨酰胺的回收率。

1.4.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3.1”步驟，配制并衍生甘氨酰-D-谷氨酰胺對照品溶液和測試溶液。分別在衍生0 h、4 h、8 h、12 h和19 h后，精密量取2 μL，注入液相色譜儀。

1.4.8 耐用性試驗(yàn)

（1）柱溫的變化范圍考察。在其余檢測條件不變的情況下，改變柱溫（18～22 ℃），考察柱溫的改變對檢測結(jié)果的影響。

（2）流動(dòng)相流速的變化范圍。在其余檢測條件不變的情況下，改變流動(dòng)相流速（0.18～0.22 mL/min），考察流速的改變對檢測結(jié)果的影響[4]。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗(yàn)

如圖1所示，在溶劑的色譜圖中未出現(xiàn)甘氨酰-D-谷氨酰胺色譜峰，表明溶劑不影響甘氨酰-D-谷氨酰胺的測定，測試溶液中甘氨酰-L-谷氨酰胺與甘氨酰-D-谷氨酰胺分離度符合要求，本方法專屬性良好。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

如表1所示，甘氨酰-D-谷氨酰胺峰面積RSD（%，n=6）值為3.06，甘氨酰-D-谷氨酰胺理論塔板數(shù)和拖尾因子均符合要求，甘氨酰-L-谷氨酰胺和甘氨酰-D-谷氨酰胺峰分離度符合要求，表明本方法系統(tǒng)適用性良好。

2.3 線性范圍試驗(yàn)

以濃度（μg/mL）與峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=13 477x+90.537，R2=0.998，表明甘氨酰-D-谷氨酰胺在0.450～6.75 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 甘氨酰-D-谷氨酰胺線性回歸曲線

2.4 靈敏度試驗(yàn)

2.4.1 檢測限試驗(yàn)

當(dāng)甘氨酰-D-谷氨酰胺濃度為135.0 ng/mL時(shí)，響應(yīng)值約為噪音的4.0倍，經(jīng)計(jì)算，本測定條件下甘氨酰-D-谷氨酰胺的檢測限為101 ng/mL，約相當(dāng)于供試品溶液的0.003%。

2.4.2 定量限試驗(yàn)

當(dāng)甘氨酰-D-谷氨酰胺濃度為450.0 ng/mL時(shí)，響應(yīng)值約為噪音的10倍，經(jīng)計(jì)算，本測定條件下甘氨酰-D-谷氨酰胺的定量限為435 ng/mL，約相當(dāng)于供試品溶液的0.01%。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn)

6份測試溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺測得的含量分別為 4.161 μg/mL、4.360 μg/mL、4.246 μg/mL、4.227 μg/mL、4.143 μg/mL 和 4.264 μg/mL，RSD（%，n=6）值為1.85，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.2 中間精密度試驗(yàn)

如表2所示，12份測試溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺測得的含量RSD（%，n=12）值為2.51，表明該方法中間精密度良好。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

如表3所示，各個(gè)濃度的回收率均在90.0%～100.0%，平均回收率為94.9%，RSD（%，n=9）為3.14，表明本方法準(zhǔn)確度良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

表2 甘氨酰-D-谷氨酰胺中間精密度試驗(yàn)測定結(jié)果

表3 甘氨酰-D-谷氨酰胺樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 測試溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

如表4所示，測試溶液中甘氨酰-D-谷氨酰胺測得的含量RSD（%，n=5）為2.91，表明測試溶液在室溫下保存，至少19 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性試驗(yàn)

如表5和表6所示，柱溫為18～22 ℃和流速為0.18～0.22 mL/min時(shí)，對甘氨酰-D-谷氨酰胺測定無顯著性影響。

表5 甘氨酰-D-谷氨酰胺柱溫變化范圍考察結(jié)果

表6 甘氨酰-D-谷氨酰胺流動(dòng)相流速變化范圍考察結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用HPLC法成功實(shí)現(xiàn)了甘氨酰-L-谷氨酰胺與甘氨酰-D-谷氨酰胺的分離測定，操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、干擾小，并通過方法學(xué)驗(yàn)證了該法對甘氨酰-D-谷氨酰胺測定的準(zhǔn)確性和可靠性，對甘氨酰-L-谷氨酰胺的安全性、有效性起到了保證作用，適用于甘氨酰谷氨酰胺中甘氨酰-D-谷氨酰胺的控制分析。