果膠酶研究進(jìn)展及應(yīng)用

傅海，趙佳，李偉，孫科，王希信

（1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250101；2.濟(jì)南市錦繡川水庫管理處，山東濟(jì)南 250112）

果膠裂解酶（Pectinases）是指能協(xié)同分解果膠質(zhì)的一組酶的總稱，是一種復(fù)合酶，是由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物，主要用于果蔬汁的澄清、咖啡和茶的發(fā)酵生產(chǎn)、榨油、紙漿漂白、棉織物處理、含果膠污水處理、木材防腐、洗滌劑和家禽飼料加工等領(lǐng)域。果膠酶通過切斷果膠C-4位置，并且從C-5處消去一個(gè)H原子，產(chǎn)生一個(gè)不飽和產(chǎn)物裂解果膠。目前果膠酶被廣泛的應(yīng)用于食品、紡織、造紙領(lǐng)域中，但目前果膠酶價(jià)格仍然頗高，亟需開發(fā)新的高產(chǎn)果膠酶菌株。本文以果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選為起點(diǎn)，介紹了果膠酶高產(chǎn)菌株研究的最新進(jìn)展及應(yīng)用。

1 果膠酶分類

果膠酶是指能協(xié)同分解果膠質(zhì)的一組酶的總稱，具體可分為原果膠酶（Protopectinases）、聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases）、果膠裂解酶（Pectin lyases，PL）和果膠酯酶等（Pectinesterase，PE）[1]。

目前果膠酶的研究主要有以下三個(gè)方面：從野外分離篩選高產(chǎn)菌株；基因重組構(gòu)建重組菌；生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化。

1.1 原果膠酶

原果膠是一種通過α-1,4糖苷鍵連接D-半乳糖醛酸殘基，主鏈中常有阿拉伯聚糖殘基、半乳聚糖殘基、α-L-吡喃鼠李糖殘基等形成側(cè)鏈將纖維素、半纖維素與蛋白質(zhì)連接組成的不溶性多糖聚合物[2]。

原果膠酶根據(jù)作用的位置不同又可分為A型原果膠酶和B型原果膠酶。A型原果膠酶主要通過水解原果膠內(nèi)部的多聚半乳糖醛酸，促使原果膠水解。B型原果膠酶對(duì)底物有很強(qiáng)的專一性，作用于連接半乳糖醛酸鏈與細(xì)胞壁之間的多糖鏈[3]。

1.2 聚半乳糖醛酸酶

聚半乳糖醛酸酶是廣泛分布于真菌與細(xì)菌中的一種果膠酶。在有水參與的條件下，聚半乳糖醛酸酶斷裂非酯化半乳糖醛酸間的α-1,4糖苷鍵。根據(jù)水解的機(jī)理不同，可分為內(nèi)切聚半乳糖醛羧酶（E.C.3.2.1.15）與外切聚半乳糖醛酸酶（E.C.3.2.1.67）,內(nèi)切聚半乳糖醛縮酶隨機(jī)地從分子內(nèi)部切斷α-1,4糖苷鍵[4]。反應(yīng)催化如式1所示。外切聚半乳糖醛縮酶從分子的末端開始，逐一切下產(chǎn)生半乳糖醛酸。反應(yīng)催化如式2所示。

1.3 果膠裂解酶

果膠裂解酶是通過反式消去作用裂解果膠聚合體的一種果膠酶。果膠裂解酶通過切斷果膠C-4位置，并從C-5處消去一個(gè)H原子，產(chǎn)生一個(gè)不飽和產(chǎn)物裂解果膠。根據(jù)作用機(jī)理與底物的不同，可分為內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶（EndoPGL，E.C.4.2.2.2）、外切聚半乳糖醛酸裂解酶（ExoPGL，E.C.4.2.2.9）、內(nèi)切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（EndoPMGL，E.C.4.2.2.10）和外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（ExoP-MGL）。

1.4 果膠酯酶

果膠酯酶（E.C.3.1.1.11）能促進(jìn)脫脂化作用，可脫去半乳糖醛酸主鏈上的甲基，釋放出果膠酸酯與甲醇。反應(yīng)催化如式3所示。

2 果膠酶的研究進(jìn)展

目前，果膠酶的研究主要從產(chǎn)果膠酶菌株的篩選、產(chǎn)果膠酶菌株的育種、生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化以及果膠酶固定化4個(gè)方面進(jìn)行。

2.1 產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

果膠酶最初是在研究蔬菜腐敗時(shí)發(fā)現(xiàn)[5]，研究發(fā)現(xiàn)果膠酶廣泛存在于真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物、昆蟲中。目前，國內(nèi)外果膠酶的生產(chǎn)菌種主要來源于微生物，利用霉菌生產(chǎn)果膠酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化[6]。

微生物產(chǎn)生的酶分為組成酶和誘導(dǎo)酶2種：組成酶是細(xì)胞內(nèi)長期存在的酶，這種酶的合成與生長發(fā)育條件無關(guān)，常進(jìn)行定量合成；誘導(dǎo)酶是在環(huán)境中存在誘導(dǎo)物（一般是反應(yīng)的底物）時(shí)，受基因調(diào)控誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶。果膠酶就是一種誘導(dǎo)酶，所以在其篩選過程中，常在培養(yǎng)基中添加果膠作為唯一碳源進(jìn)行篩選。

常用的產(chǎn)果膠酶菌株篩選方法有高碘酸法、剛果紅法、溴酚藍(lán)法，其詳細(xì)篩選方法如下：（1）高碘酸法。果膠降解產(chǎn)物可以溶于高碘酸，通過向篩選培養(yǎng)基中加入碘液，觀察透明圈大小，篩選出透明圈與菌落直徑比大的菌株[7]。（2）剛果紅法。剛果紅可以與大分子多糖結(jié)合，產(chǎn)生有色復(fù)合物。隨著多糖分子量的變化，剛果紅結(jié)合程度會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致顏色從深紅到淡黃色的變化。產(chǎn)果膠酶菌株篩選中通過對(duì)剛果紅染色產(chǎn)生的有色透明圈與菌落直徑比篩選菌株。張耀廣等[8]利用剛果紅染色法從陳化煙葉中篩得多株果膠酶產(chǎn)生菌。（3）溴酚藍(lán)法。酸性條件下，果膠降解物可與溴酚藍(lán)反應(yīng)生成黃色透明圈，根據(jù)透明圈大小可以判定果膠酶活的大小[9]。除了以上方法外，還有人利用加入的1% CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）觀察水解圈的生成，判定果膠酶產(chǎn)生菌[10]。除了利用顯色法與觀察有色產(chǎn)物的方法外，還可直接測(cè)定果膠酶活性，利用DNS法（二硝基水楊酸法），測(cè)量235 nm處吸光值[6]。產(chǎn)果膠酶菌株的篩選方法種類豐富，但主要以顯色法觀察水解圈為主，具體選擇哪一種方法還要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況與條件確定。

2.2 產(chǎn)果膠酶菌株的育種

為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求，果膠酶的研究熱點(diǎn)正逐步由菌種篩選的研究轉(zhuǎn)向誘變育種與基因工程菌構(gòu)建等分子生物學(xué)內(nèi)容。

2.2.1 誘變育種

誘變育種常見的方法有紫外誘變、化學(xué)試劑誘變、微波誘變和激光誘變等。由田等研究者[11]以從漚麻池中分離篩選出的HDYM-02菌株為出發(fā)菌株，通過紫外誘變，篩得一株在24 h時(shí)酶活力為49 U并達(dá)到產(chǎn)酶高峰期的菌株UV-21，較出發(fā)菌株酶活力提高了1.6倍。杜國軍等[12]利用甲基磺酸乙酯（EMS）處理黑曲霉，經(jīng)過篩選獲得了一株產(chǎn)果膠酶能力達(dá)到2 290 U/g的高產(chǎn)果膠酶菌株HY-M27，產(chǎn)果膠酶能力是出發(fā)菌株的2.91倍。張佰清等[13]在誘變過程中通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定了最佳的脈沖強(qiáng)光誘變條件，脈沖電壓2 075 V、脈沖次數(shù)36次、脈沖距離5.4 cm，在此條件下篩出的一株高產(chǎn)果膠酶突變菌株L9，酶活力達(dá)到（188.21±1.22）U/mL，比出發(fā)菌株提高了1.8倍[13]。除了采用單一的突變方式，有研究者嘗試采用復(fù)合誘變技術(shù)，大大提高了產(chǎn)果膠酶菌株的產(chǎn)酶能力。杜國軍等[14]采用微波-硫酸二乙酯復(fù)合誘變育種的方式，以黑曲霉HY-D7為出發(fā)菌株，采用微波與化學(xué)試劑硫酸二乙酯作為誘變劑處理黑曲霉孢子懸浮液，經(jīng)過篩選，得到高產(chǎn)果膠酶菌株HY-Z40，產(chǎn)果膠酶活性是出發(fā)菌株的2.51倍。還有研究者采用基因組改組的方式獲得了高產(chǎn)果膠酶菌株。陳幸鴿[15]通過多種誘變方式獲得正突變菌株，制備原生質(zhì)體，滅活原生質(zhì)體后利用PEG（聚乙二醇）誘導(dǎo)融合，進(jìn)行再生、篩選獲得高產(chǎn)果膠酶菌株FS105，酶活性是原始菌株的1.63倍。但誘變育種不確定性較大，往往需要大量的試驗(yàn)才能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

2.2.2 基因工程育種

隨著技術(shù)的進(jìn)步，利用基因工程技術(shù)重組構(gòu)建工程菌，大大縮短了從探索到工業(yè)應(yīng)用的時(shí)間，避免了傳統(tǒng)的誘變育種存在的盲目性。

劉曉肖等[16]全基因合成了來源于類芽孢桿菌的堿性果膠酶基因pel，并將其克隆至pHKA載體上，成功實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)；并對(duì)信號(hào)肽和啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化，使得搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)168 h，果膠酶酶活性達(dá)到432.36 U/mL。何玉蘭[17]將黑曲霉果膠裂解酶基因家族的5個(gè)果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）成功克隆，篩選得到兩個(gè)高表達(dá)酸性果膠裂解酶基因pelA和pelD，轉(zhuǎn)化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，在搖瓶發(fā)酵條件下最高酶活性分別為11 069.2 U/mL和8 822.6 U/mL。

2.3 果膠酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過基因工程技術(shù)構(gòu)建的果膠酶高產(chǎn)菌株，不能直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，還需進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行確定和優(yōu)化。高產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件確定常常使用單因素實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面分析法。王克芬等[18]利用單因素實(shí)驗(yàn)法，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源、氮源、無機(jī)鹽、磷酸鹽、溫度、pH與接種量進(jìn)行了優(yōu)化，確定了枯草芽孢桿菌的最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為馬鈴薯淀粉35 g/L、豆餅粉30 g/L、氯化鈣2.775 g/L、硫酸鋅4.025 g/L、Na2HPO4113.6 g/L和果膠20 g/L；最優(yōu)發(fā)酵控制工藝為發(fā)酵溫度35 ℃、接種量3%。單因素試驗(yàn)無法考慮因素之間的相互作用，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。周熠[19]使用響應(yīng)面分析法，預(yù)測(cè)最佳條件，將菌株LYS-5304產(chǎn)果膠酶的酶活力從370.71 U/mL提升到809.30 U/mL。

2.4 果膠酶固定化研究

生物酶具有催化活性高、底物專一性強(qiáng)和對(duì)環(huán)境無污染的優(yōu)點(diǎn)，但在工業(yè)應(yīng)用中，果膠酶直接加入到生產(chǎn)中，很難再回收利用，提高了生產(chǎn)成本。于是有學(xué)者采用了固定化酶技術(shù)來提高回收利用率，以降低生產(chǎn)成本。

酶固定化技術(shù)通過物理或化學(xué)方法將游離酶和相應(yīng)載體結(jié)合起來，從而增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性，利于保存運(yùn)輸；同時(shí)又能將酶與底物分離，達(dá)到重復(fù)利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化學(xué)方法有共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法等。漆丹萍等[20]利用吸附法在HPD-750樹脂上固定果膠酶后，得到相較游離果膠酶pH適用范圍更廣泛、熱穩(wěn)定性更好并可以重復(fù)使用10次左右的固定化酶。余春柳等[21]用點(diǎn)擊化學(xué)法制備了固定化漆酶并在催化染料降解方面得到了應(yīng)用。

3 結(jié)語

果膠酶在食品、紡織業(yè)與造紙業(yè)等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，應(yīng)用效果良好，是一種十分重要的酶，未來應(yīng)用范圍及用量還將不斷擴(kuò)大。但目前價(jià)格相對(duì)于化學(xué)藥品仍較為昂貴，為了促進(jìn)其更好的應(yīng)用，需要在以下4個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：（1）繼續(xù)篩選、分離純化優(yōu)良的野生型果膠酶生產(chǎn)菌株；（2）通過基因工程技術(shù)構(gòu)建新的果膠酶高產(chǎn)菌株；（3）不斷優(yōu)化果膠酶生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工藝；（4）繼續(xù)探索更好的果膠酶固定化方式。