灌木與喬木曬青茶生化成分與抗氧化活性研究比較

焦文文 念波 陳立佼 劉倩葶 蔣賓 張正艷 劉明麗 馬燕 趙明

摘 ?要：在灌木茶樹留養(yǎng)改造形成喬木茶樹的過程中，出現(xiàn)了改造中的灌木茶樹、喬木茶樹以及改造后的喬木茶樹3種類型的茶樹。本文對不同季節(jié)的上述3類茶樹加工的曬青茶葉的生化成分與抗氧化活性進行比較研究。應用分光光度法、高效液相色譜法測定曬青茶的各內(nèi)含成分含量，發(fā)現(xiàn)除蘇氨酸、精氨酸和γ-氨基丁酸外，喬木曬青茶的茶氨酸、谷氨酸等15種氨基酸含量與游離氨基酸總量均高于灌木曬青茶（P<0.05），而喬木曬青茶的茶多酚、沒食子酸、1，4，6-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的含量顯著低于灌木曬青茶（P<0.05），感官審評表明灌木曬青茶滋味較喬木曬青茶苦澀;正交偏最小二乘法（OPLS-DA）分析表明，兩類茶聚成不同簇，進一步證實了茶葉生化成分存在差異。春季樣品中，除羥自由基清除能力無顯著差異外，喬木曬青茶的總抗氧化能力、DPPH自由基和超氧陰離子清除能力均顯著高于灌木曬青茶（P<0.05）;秋季樣品中，喬木曬青茶的總抗氧化能力顯著高于灌木曬青茶（P<0.05），但喬木曬青茶的超氧陰離子清除率則顯著低于灌木曬青茶（P<0.05），而DPPH和羥自由基清除活性二者差異不顯著（P>0.05）。綜上，與灌木曬青茶比較，改造形成的喬木曬青茶的氨基酸含量提高，多酚含量降低，苦澀度降低，部分抗氧化活性指標提高，表明灌木茶樹留養(yǎng)改造成喬木茶樹，能夠提高曬青茶品質(zhì)。

關鍵詞：喬木茶;灌木茶;生化成分;抗氧化活性

中圖分類號：S571.1;TS272.5 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Bush， transforming and transformed arbor tea trees would be formed during the transformation of tea plantation from bush to arbor trees. In this study， the biochemical components and antioxidant activities of sun-dried green tea processed by the above three kinds of tea plants were compared. The contents of various components were determined by spectrophotometry and high performance liquid chromatography methods. The content of theanine， glutamic acid and other 15 amino acids in arbor tea were higher than those in bush tea， exception threonine， arginine and gamma-aminobutyric acid （P<0.05）， while the content of tea polyphenols， gallic acid， 1，4，6-O-gallic acyl-beta- D-glucose and epigallocatechin gallate （EGCG） in arbor tea were significantly lower than those in bush tea （P<0.05）. Sensory evaluation showed that the taste of bush tea was bitterer than that of arbor tea. Arbor and bush tea grouped into different clusters in orthogonal partial least squares analysis of the content of the compounds， which confirmed the difference of the biochemical components between these two teas. The activities of spring arbor tea including the total antioxidant capacity， DPPH free radical and superoxide anion scavenging capacity were higher than those of bush tea （P<0.05）， while hydroxyl radical scavenging abilities between these two types of teas were not different. In autumn tea， the total antioxidant capacity of arbor tea was higher than that of bush tea （P<0.05）， while the scavenging capacity of superoxide anion were lower than bush tea （P<0.05）， while the scavenging capacities of hydroxyl free radical and DPPH were not different （P>0.05）. In summary， comparison to bush sun-dried green tea， the content of amino acid in arbor tea was increased， and the level of polyphenol and bitterness were reduced. Partial antioxidant activities were also increased. Thus， the transformation of tea plantation from bush to arbor tree can improve the quality of sun-dried green tea.

Keywords： arbor tea; bush tea; biochemical composition; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.025

古樹茶一般是指樹齡百年以上的喬木型茶樹鮮葉加工的茶葉產(chǎn)品[1]，由于其稀有性與獨特的品質(zhì)特征，深受市場和消費者青睞。近年來，隨著古茶樹保護及茶產(chǎn)業(yè)生態(tài)發(fā)展理念的推廣[2-4]，云南省普洱市等地區(qū)，出現(xiàn)了灌木茶樹留養(yǎng)形成喬木茶樹的茶園改造[5]（圖1A），即：間隔性保留1～2株茶樹不修剪，待未修剪茶樹長成喬木后，砍伐其它灌木型茶樹，最終形成喬木茶園（圖1C）;在留養(yǎng)過程中便出現(xiàn)了灌木型與喬木型茶樹間作的過渡型茶園（圖1B）。

有重要影響，如鞏雪峰[6]研究發(fā)現(xiàn)，林茶復合栽培和大棚茶園能夠提高茶葉品質(zhì);肖正東等[7]發(fā)現(xiàn)，茶園間種銀杏或板栗可提高茶葉水浸出物、咖啡因、氨基酸含量，降低茶多酚含量，提高茶葉品質(zhì);楊海濱等[8]報道茶馬尾松、茶竹間作模式，能夠提高綠茶品質(zhì);葉晶等[9]研究得出，茶柿間作可以提高茶葉水浸出物、咖啡堿、氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量;余冬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，傘狀或球形狀茶樹模式能夠提高茶葉品質(zhì)。另外，王晶[11]的研究表明，古樹茶口感比原生茶（荒野茶）好，原生茶口感好于臺地茶。本研究調(diào)查的茶樹栽培模式是將灌木型茶樹改造成喬木型茶樹，市場上一般認為喬木茶品質(zhì)高于灌木茶[12-13]，經(jīng)查閱文獻，未見針對茶園改造中形成灌木型、喬木型和改造后的喬木型茶葉品質(zhì)比較研究。

本文追蹤調(diào)查云南省普洱市某灌木茶樹留養(yǎng)形成喬木茶樹生態(tài)茶園的改造情況，并分別采摘鮮葉加工制備曬青茶，分析曬青茶的生化成分、抗氧化活性，結合感官審評結果，應用正交偏最小二乘法（OPLS-DA）模型比較灌木、喬木曬青茶的品質(zhì)差異，為灌木茶樹留養(yǎng)形成喬木茶樹的生態(tài)茶園的改造提供依據(jù)和參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?調(diào)查取樣的灌木茶樹留養(yǎng)形成喬木茶樹的生態(tài)茶園位于云南省寧洱縣大黑山（10123E，231911N），對該茶園區(qū)域面積、海拔、經(jīng)緯度、地形、坡向、防護林與遮陰樹、氣溫、降水量、茶園地上植物、土壤、病害等生態(tài)數(shù)據(jù)和茶樹植物學形態(tài)特征進行了調(diào)查。分別在春季、秋季采摘喬木茶園喬木型茶樹（At1）、過渡茶園喬木型茶樹（At2）、過渡茶園灌木型茶樹（Bt）一芽二葉鮮葉，按照曬青茶加工標準制成曬青茶樣。

乙腈、甲醇，均為色譜純，Sigma公司;標準品咖啡堿（CA）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子酸兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）、1，4，6-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖（GG）、鞣花酸（EA）、楊梅素（My）、槲皮素（Qu）、木犀草素（Lu）、山奈酚（Kf）、飛燕草色素（Dp）、矢車菊色素（Cy）、天竺葵色素（Pg），天津一方科技有限公司;天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）標準品，美國安捷倫公司;茶氨酸（Thean）、γ-氨基丁酸（GABA）標準品，中國藥品生物制品檢定所。硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、食用乙醇、茚三酮、三氯化鋁、氫氧化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 ?儀器與設備 ?1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），AR-1140電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）、DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱（上海中友儀器設備有限公司）、756CRT紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茶葉生化成分測定 ? 應用全量法[14]、酒石酸鐵比色法[15]、茚三酮比色法[16]和蒽酮比色法[17]分別測定葉水浸出物（WE）、茶多酚（TP）、游離氨基酸（AA）和可溶性糖（SS）含量。應用實驗室前期建立的HPLC法[18-19]分別測定樣品中兒茶素、沒食子酸、咖啡堿、黃酮類的含量及17種氨基酸組分含量。

應用實驗室建立的HPLC法測定茶葉樣品花青素含量，主要方法與操作如下：（1）樣品提取：稱取1.0 g茶葉磨碎樣品，加入40 mL甲醇，再加入4 mL鹽酸，85 ℃水浴90 min，過濾于50 mL容量瓶，定容至50 mL，測定前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測。（2）HPLC檢測：使用TSKgel ODS-80TM色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm，日本 TOSOH）分離;流動相A為0.2%磷酸，流動相B為80%甲醇;洗脫梯度程序為：0～0.5 min B液從10%線性梯度增加至45%;0.5～10 min，B液從45%增加至50%;10～18 min，B液從50%增加至85%;18～18.2 min，B液從85%增加至100%;18.2～21.5 min，B液100%保持不變;21.5～ 21.9 min，B液從100%降低至10%，22 min程序停止;以10% B液后運行平衡6 min;進樣量5 μL，流速0.8 mL/min;柱溫為40 ℃;檢測波長530 nm;由保留時間確定化合物，使用外標法根據(jù)峰面積定量。

1.2.2 ?體外抗氧化活性測定 ? 曬青茶樣液制備：精密稱取磨碎茶樣1.00 g，加45 mL蒸餾水，沸水浴浸提45 min（每隔10 min搖1次），趁熱過濾至50 mL容量瓶，濾渣用少量沸水沖洗數(shù)次，冷卻后定容，所得茶湯稀釋至適合濃度[20]，待測。

清除DPPH自由基能力測定[21]：取茶湯稀釋1000倍后測定。精密吸取2 mL已經(jīng)配置好的0.04 mg/mL DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇于試管中，充分搖勻后避光反應15 min，用無水乙醇作為空白對照，在波長517 nm處測定吸光值，記為A0;用樣品稀釋液代替無水乙醇，其余操作同上，測得吸光值記為A1;用樣品稀釋液代替DPPH無水乙醇溶液，其余操作同上，測得吸光值記為A2。按如下公式計算樣品對DPPH自由基的清除率：

取茶湯稀釋40倍，按試劑盒內(nèi)說明書測定清除羥自由基（·OH）活性。取茶湯稀釋4倍，采用鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子（·O2）活性[22]。取茶湯稀釋13倍，按試劑盒內(nèi)說明書測定總抗氧化能力。

1.2.3 ?感官審評 ? 根據(jù)GB/T 23776—2018[23]對樣品的外形和內(nèi)質(zhì)進行審評。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

生化成分測定每個樣品提取2次，每個提取測定3次重復，以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數(shù)法進行兩兩比較;用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析（orthog- onal partial least squares discrimination analysis， OPLS-DA），為防止模型過擬合，采用7次循環(huán)交互驗證和200次響應排序檢驗的方法來考察模型的質(zhì)量[24];用Origin 8.0軟件繪圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?茶園及茶樹植物學特性調(diào)查

本研究調(diào)查的茶園始建于20世紀70年代，2010年開始改植為過渡型茶園，2015年改造為喬木茶園。兩類茶園均位于向陽坡地上，海拔1880 m左右，年均氣溫在17 ℃左右，降水量1200～1800 mm。茶園土壤為疏松潮濕的松沙腐質(zhì)土壤，土層深厚。茶園內(nèi)植有香樟、三角楓等遮陰植物，地上植物豐富。所調(diào)查的At1、At2、Bt 3種類型的茶樹中，At1、At2型屬小喬木型，基部主干明顯，主干直徑10 cm以上，樹高3 m以上，呈直立、半開展狀，株間距較大;Bt型茶樹屬灌木型，主干不明顯，樹高1 m左右，呈開展狀，株間距較密集，每畝B型茶樹株樹分別約為At1、At2型茶樹的14倍。3種形態(tài)的茶樹冠幅由Bt、At2、At1呈現(xiàn)依次增大的趨勢（表1），經(jīng)過改植后的茶樹葉片面積有所減小。

2.2 ?曬青茶感官審評

感官審評結果見表2。制備的樣品均具有曬青茶的典型特征：外形條索緊結、肥壯，黃褐勻整;湯色黃綠明亮;香氣為清香。但喬木曬青茶相較灌木曬青茶茶，滋味更鮮爽，灌木曬青茶茶滋味稍苦澀，且喬木曬青茶茶的香氣較之灌木曬青茶茶清香更加持久。

2.3 ?茶葉生化成分

各曬青茶樣的水浸出物、茶多酚、氨基酸、兒茶素、咖啡堿等化合物含量見表3。春季樣品中，灌木曬青茶的C、EC、矢車菊、天竺葵色素和楊梅素、槲皮素、游離氨基酸、可溶性糖以及氨基酸各組分的含量均顯著低于喬木曬青茶（P<0.05），而ECG、GG、EGCG、GA、EGC、山奈酚、鞣花酸、咖啡堿、茶多酚的含量顯著高于喬木曬青茶（P<0.05）。秋季樣品中，灌木曬青茶中EC、C、ECG、槲皮素、咖啡堿、可溶性糖、游離氨基酸，以及除GABA、精氨酸外的15種氨基酸含量均顯著低于喬木曬青茶（P<0.05），而EGC、GG、GA、EGCG、GABA、精氨酸、茶多酚、花青素、黃酮類的含量顯著高于喬木曬青茶（P<0.05）。

本研究進一步對所測成分進行OPLS-DA分析，得到了載荷散點圖（圖2A、圖2B）。春季樣品模型質(zhì)量參數(shù)R2X=0.876，R2Y=0.983，Q2= 0.907;秋季茶樣模型質(zhì)量參數(shù)R2X=0.945，R2Y= 0.99，Q2=0.958，表明模型擬合較好。運用統(tǒng)計推斷分析進一步驗證鑒別模型，圖2C和圖2D分別為春季、秋季的OPLS-DA 模型置換驗證圖。春季模型的R2和Q2截距值分別為0.576和0.91，秋季模型的R2和Q2截距值分別為0.614和1.11。說明建立的OPLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預測能力。由圖2A和圖2B可看出各曬青茶樣均聚成3簇，表明所測定的3類曬青茶生化成分存在差異。在載荷圖中，位于樣本附近的化合物含量較高，與樣本較遠的化合物含量較低[25]。由圖2A和圖2B可知，EGCG、EGC、GA、GG、茶多酚等化合物均位于灌木曬青茶附近，這說明上述化合物在灌木曬青茶中的含量相對較高;而各種氨基酸、游離氨基酸、C、EC等化合物均位于喬木曬青茶附近，說明這些化合物在喬木曬青茶中的含量相對較高。

2.4 ?抗氧化活性比較

抗氧化活性測定顯示，各曬青樣DPPH自由基清除率為35.21%～47.23%（圖3A），超氧陰離子自由基清除率為32.98%～45.73%（圖3B），羥自由基清除率為42.98%～52.63%（圖3C），總抗氧化能力為49.23～57.60 U/mg（圖3D）。春季的喬木曬青茶樣品，除了羥自由基清除活性與灌木曬青茶差異不顯著（P>0.05），其余3種抗氧化活性均顯著高于灌木曬青茶（P<0.05）;秋季茶樣中，喬木曬青茶的總抗氧化能力顯著高于灌木曬青茶（P<0.05），但喬木曬青茶的超氧陰離子清除率則顯著低于灌木曬青茶（P<0.05），而二者的DPPH自由基和羥自由基清除活性差異不顯著（P< 0.05）。

3 ?討論

本研究發(fā)現(xiàn)，由于茶樹栽培模式的改變，使得茶樹形態(tài)發(fā)生了變化，由原來的灌木型茶樹變成了喬木型茶樹，其茶葉品質(zhì)也存在較大差異。通過感官審評發(fā)現(xiàn)喬木曬青茶的滋味較為鮮爽，灌木曬青茶滋味稍苦澀，且喬木曬青茶香氣更加持久。而以測定的喬木和灌木曬青茶的生化成分進行OPLS-DA分析，進一步證實了喬木與灌木曬青茶在生化成分上的差異。喬木曬青茶中除了蘇氨酸、GABA和精氨酸外，其余氨基酸組分的含量均高于灌木曬青茶，而EGCG、EGC、GA、GG以及茶多酚等物質(zhì)含量低于灌木曬青茶。茶葉中茶多酚與氨基酸是決定綠茶品質(zhì)的重要物質(zhì)[26]，茶多酚是造成茶葉苦澀味的主要物質(zhì)[27]，氨基酸是茶湯鮮爽的主要物質(zhì)[28]，兒茶素中EGCG、EGC與茶葉的苦澀度有關[29]。因此推斷，喬木曬青茶樣品中多酚類物質(zhì)的含量較低，而氨基酸類的含量較高，是其滋味較灌木曬青茶鮮爽的主要原因。

梁名志等[12]的研究認為，老樹茶的茶多酚、兒茶素類含量高于臺地茶，而臺地茶的水浸出物、氨基酸、黃酮類含量上則高于老樹茶，這與本研究結果有所差異，這可能與材料不同、產(chǎn)地不同等因素有關;但是感官審評認為老樹茶茶湯口感優(yōu)于灌木茶;這與本研究一致。陳繼偉等[30]研究認為，大樹茶氨基酸含量顯著高于臺地茶，兒茶素含量、酚氨比值顯著低于臺地茶，審評結果也表明，大樹茶滋味鮮爽回甘，而灌木茶滋味濃帶苦澀;王晶[11]認為，古樹茶湯口感協(xié)調(diào)性好、回甘明顯，灌木茶湯苦澀較重。這些結果均與本研究一致。

本研究除了分析和比較改造過程中的灌木、喬木曬青茶的生化成分，還測定了其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)改造后形成的喬木曬青茶部分抗氧化指標得到了提高，尤其是總抗氧化能力，無論是春季還是秋季均是喬木曬青茶高于灌木曬青茶，這可能與改造后的喬木曬青茶生化成分變化有關。因此，灌木茶樹留養(yǎng)改造成喬木茶樹后，多酚類含量降低，氨基酸類含量提高，苦澀度降低，可明顯提高曬青茶品質(zhì)。

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