芒果中性/堿性轉化酶MiNI基因的克隆與表達分析

郭利軍 鄧會棟 馮學杰 羅志文 陳哲 范鴻雁 胡福初 華敏

摘 ?要：采用RT-PCR技術克隆了1個編碼NI基因的cDNA序列，命名為MiNI基因，并對不同來源的中性/堿性轉化酶的分子特征及系統進化進行比較分析。結果表明：MiNI基因開放閱讀框為2034 bp，編碼677個氨基酸，相對分子量為76.6 kDa，理論等電點為6.24;生物信息學分析結果顯示，NI二級結構α螺旋占38.85%，無規(guī)則卷曲占35.45%，伸展鏈占18.91%，β折疊占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100結構保守域，與克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹和番木瓜都具有一致的motif位點;MiNI基因編碼的氨基酸序列與克里曼丁桔、龍眼氨基酸序列同源性最高;構建NI系統進化樹分析表明，與芒果遺傳距離最近的是克里曼丁桔，最遠的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析顯示，果皮MiNI基因表達量遠高于果肉;花后10～40 d，果皮MiNI基因表達量顯著下降;花后40～100 d，果皮MiNI基因表達量維持在一個相對穩(wěn)定水平;花后100～130 d，隨著果實成熟，果皮MiNI基因表達量又顯著上升;而花后10～40 d，果肉MiNI基因表達量顯著下降，至果實發(fā)育后期果肉MiNI基因表達量始終處于極低水平。該研究為進一步了解MiNI基因在芒果果實蔗糖代謝過程中的作用以及從分子角度闡明芒果糖代謝機理奠定理論和技術基礎。

關鍵詞：芒果;中性/堿性轉化酶;克隆;生物信息學;表達分析

中圖分類號：S667.7;S961.6 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The cDNA sequence of alkaline/neutral invertase （NI） gene （MiNI） in mango was cloned with Reverse Tran-scription Polymerase Chain Reaction （RT-PCR） in this study. The molecular properties and genetic relationships of NI were compared with different organisms. MiNI contained an open reading frame of 2034 bp， encoding a protein of 677 aa with a theoretical molecular weight 76.6 kDa and an isoelectric point of 6.24. Bioinformatics analysis showed that the secondary structure of NI consisted of alpha helix accounting for 38.85%， random coil accounting for 35.45%， extended strand accounting for 18.91%， and beta turn accounting for 6.79%， of which had the conserved domain of glycoside hydrolase family 100 and the same motif locations as Citrus clementine， Dimocarpus longan， Hevea brasiliensis and Carica papaya. The amino acid sequence encoded by MiNI had the highest homology with that of Citrus clementine， Dimocarpus longan. The analysis of NI phylogenetic tree showed that the closest genetic distance between mango was Citrus clementine， the furthest were Zea mays and Lycium barbarum. qRT-PCR analysis showed that the expression of MiNI in exocarp was much higher than that in mesocarp. MiNI relative expression in exocarp decreased significantly during 10 to 40 days after flowering， while the gene relative expression was maintained at a relatively stable level during 40 to 100 days after flowering. However， MiNI expression increased significantly with fruit ripening during the period from 100 to 130 days after flowering. The gene expression in mesocarp was different from that in exocarp. The gene expression of MiNI in mesocarp decreased significantly during 10 to 40 days after flowering， while the gene relative expression remained at a very low level until the later stage of fruit development. The study would provide a foundation to understand the role of MiNI in sucrose metabolism and further dissection of the sugar metabolism mechanism from molecular perspective.

Keywords： Mangifera indica L.; alkaline/neutral invertase; cloning; bioinformatics; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.003

芒果（Mangifera indica L.）是漆樹科常綠大喬木，原產于印度半島至東南亞一帶，素有“熱帶果王”之美譽，全世界有84個國家生產芒果。近十幾年來，海南省芒果種植面積一直穩(wěn)定在4.67萬hm2左右，據農業(yè)農村部2017年全國熱帶作物生產統計和海南省統計年鑒統計數據顯示，截至2017年底，全國芒果種植面積25.79萬hm2，收獲面積16.31萬hm2，全年總產量207.44萬t，總產值114.45億元，海南芒果種植面積5.45萬hm2，收獲面積4.43萬hm2，產量56.73萬t，產值28.93億元，分別占全國的21.12%、27.16%、27.35%和25.28%，海南種植面積、產量和產值分別居全國第三、第二和第一位。

作為高等植物光合作用的主要產物，蔗糖在果實發(fā)育過程中發(fā)揮著無可替代的重要作用。轉化酶（invertase， INV）是促使蔗糖進入各種代謝途徑的關鍵酶，其催化蔗糖不可逆水解為葡萄糖和果糖[1]。根據最適pH，INV可分為酸性轉化酶（acid invertase， AI）和中性/堿性轉化酶（alkaline/neutral invertase， NI）;根據亞細胞定位，可分為細胞壁轉化酶（cell wall invertase， CWIN）、細胞質轉化酶（cytoplasmic invertase， CIN）和液泡轉化酶（vacuolar invertase， VIN），CWIN和VIN屬酸性轉化酶，CIN屬中性轉化酶[2]。已有的研究結果表明，NI是研究蔗糖代謝的關鍵酶之一[3]，芒果糖代謝研究也不例外。趙家桔[4]的研究結果表明，‘貴妃芒‘金煌芒‘紅玉芒成熟階段果實中的果糖含量與AI、NI活性呈顯著相關，蔗糖含量與蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性呈顯著相關;但魏長賓等[5-6]研究‘愛文芒和‘粵西1號芒后熟階段AI、SS、SPS的活性顯著增加，NI活性略有增加;武紅霞等[7]的研究結果表明，造成‘臺農1號芒果實蔗糖積累的主要原因是成熟階段SPS、SS活性的增加及AI活性的降低，而果實發(fā)育進程中NI活性變化不大。截至目前，已有報道在龍眼[8]、甘蔗[9]、茶樹[10]、番茄[11]等作物上相繼克隆NI基因并開展相關研究，雖然芒果上已有上述關于NI酶活性的報道，但有關芒果NI基因的克隆及表達分析尚未見報道。

為了明確NI基因在果實發(fā)育進程中的作用，筆者以不同發(fā)育階段的‘臺農1號果實為材料，克隆芒果NI基因，命名為MiNI，登錄號（GenBank No： MN893670），并對其編碼蛋白和MiNI基因在果實不同發(fā)育階段的表達情況進行分析，為從分子角度闡明NI基因在果實發(fā)育進程中的作用及明確芒果糖代謝機理奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗材料為種植于海南省樂東縣黃流鎮(zhèn)佛老村10年生‘臺農1號芒果，芒果出花后至采收，僅進行防病蟲藥物噴施，不再進行任何處理。選取樹勢、冠幅、花期相對一致的植株3株為采樣對象，分別于花后10、40、70、100、130 d采集不同發(fā)育階段的芒果果實，隨后立即分離果皮和果肉，快速裝入提前備好的錫箔紙后，馬上放入液氮，返回實驗室后置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取和cDNA合成 ?RNA提取采用北京華越洋科技有限公司的華越洋普通RNA提取試劑盒，具體提取方法參照試劑盒說明書;cDNA第一鏈的合成采用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScript? II Reverse Transcriptase試劑盒，反轉錄方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 ?MiNI基因全長cDNA的克隆 ?利用NCBI網站搜索已公布的NI基因片段序列，通過序列比對找到同源序列，再通過本地Blast從芒果轉錄組測序數據（SRP035450）[12]抓取MiNI基因，使用Snapgene 3.2.1軟件尋找開放閱讀框，利用Primer 5.0在MiNI基因開放閱讀框起始端和終止端設計特異引物，MiNIF為5-ATGAATACTGGTAGC TGTATTGGAATC-3，MiNIR為5-TTAAATGA TAATCTTGGTTCTTGAGGC-3，PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。獲得MiNI基因開放閱讀框序列，連接載體轉化大腸桿菌挑陽性菌液測序，得到MiNI基因編碼區(qū)序列。

1.2.3 ?MiNI基因生物信息學分析 ?利用NCBI數據庫Blast程序對MiNI基因進行同源分析;利用Snapgene 3.2.1軟件尋找開放閱讀框，分析編碼的氨基酸序列組成和分子量;利用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam）分析編碼蛋白的等電點等理化性質;利用NCBI網站Conserved Domains Search功能查找蛋白保守功能結構域;利用Phyre2網站（http：//www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和PyMOL軟件預測MiNI基因編碼蛋白三級結構;使用MEME（http：//meme-suite.org/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件進行Motif位點分析和功能結構分析，采用Mega 5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4 ?芒果果實不同發(fā)育期MiNI基因的表達分析 ?提取芒果果實不同發(fā)育時期果皮和果肉的RNA，RNA樣本中的DNA利用RNase-free DNase I進行消化，消化后1 μg的總RNA用來合成cDNA第一鏈。實時熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq熒光染料，在ABI StepOnePlusTM（Ambion， Foster City， CA）儀器上進行。利用Primer 5.0于MiNI基因非保守區(qū)設計熒光定量PCR引物，MiNI-RTF 5-GAGTATGAGGAATGGCGTAT-3，MiNI-RTR 5-CAAGTATGGTAGCGAGGG-3，以果期穩(wěn)定表達的MiEF基因為內參基因[8]。采用2步法進行熒光定量PCR，反應程序為：95 ℃，30 s;95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40個循環(huán);采用Wang等[9]的方法分析溶解曲線，采用2CT法進行相對定量分析，計算出MiNI基因在不同階段的相對表達量。

2 ?結果與分析

2.1 ?MiNI基因全長cDNA的克隆

提取芒果果實總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，反轉cDNA;以cDNA為模板，根據編碼區(qū)起始端、終止端序列設計的特異引物進行MiNI基因編碼區(qū)PCR擴增，凝膠電泳結果顯示，目的條帶約2000 bp（圖1）?；厥漳康臈l帶，連接克隆載體后測序，測序結果與轉錄組測序結果一致，證實已成功克隆MiNI基因的cDNA編碼區(qū)。

2.2 ?MiNI基因生物信息學分析

2.2.1 ?理化性質分析 ?克隆的MiNI基因開放閱讀框為2034 bp，編碼677個氨基酸，相對分子量為76.6 kDa，理論等電點為6.24，分子式為C3431 H5373N927O1000S32，不穩(wěn)定系數（Instability index）為38.67，屬于穩(wěn)定蛋白;親水性為0.222，屬親水性蛋白;Proparam在線軟件分析MiNI基因編碼蛋白的氨基酸組成情況，結果發(fā)現Leu含量較高。

2.2.2 ?蛋白結構分析 ? 蛋白質二級結構預測結果發(fā)現，MiNI基因編碼蛋白的二級結構主要以α螺旋（alpha helix， 38.85%）和無規(guī)則卷曲（random coil， 35.45%）為主，同時也有少量的伸展鏈（extended strand， 18.91%）和β折疊（beta turn， 6.79%）結構;將MiNI基因編碼的氨基酸序列與其他物種NI基因編碼的氨基酸進行比對，結果發(fā)現均具有glycoside hydrolase family 100保守結構域和GDE_C保守結構域，利用NCBI網站Conserved Domains Search功能，查找保守功能結構域發(fā)現，MiNI基因編碼的第198～634氨基酸序列為glycoside hydrolase family 100特定匹配序列，第381～435氨基酸序列為GDE_C特定匹配序列（圖2）。

2.2.3 ?同源性分析及進化關系分析 ?通過NCBI blastp程序比對發(fā)現，MiNI基因編碼氨基酸與柑橘屬的克里曼丁桔（Citrus clementina）NI基因（XP_006419305.1）編碼氨基酸同源性最高，達84.62%;與龍眼（Dimocarpus longan）NI基因（AJW82915.1）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）NI基因（AGQ57013.1）、番木瓜（Carica papaya）NI基因（XP_021906847.1）、菠蘿（Ananas comosus）NI基因（OAY70851.1）、葡萄（Vitis vinifera）NI基因（CBI39621.3）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）NI基因（NP_001319483.1）、玉米（Zea mays）NI基因（AQK52953.1）編碼氨基酸同源性分別為82.48%、79.39%、76.16%、73.88%、70.47%、68.09%、59.48%。

使用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件Motif Discovery功能，對與芒果NI同源性較高的克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹、番木瓜NI蛋白序列進行Motif位點分析，得到10個保守基序，結果顯示芒果NI與克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹、番木瓜NI具有一致的Motif位點（圖3）;對10個保守基序進行功能注釋，SWISS-MODEL分析結果表明，Motif 3-10均為homo-hexamer結構，功能注釋為中性轉化酶，Motif 1-2未得到其結構功能信息（表1）。

以MiNI基因編碼氨基酸序列為目標序列，在NCBI進行Blast比對，下載各同源序列;利用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining法進行氨基酸序列進化分析，比對結果發(fā)現，MiNI基因編碼的氨基酸與柑橘屬的克里曼丁桔和龍眼的關系最近，與玉米和枸杞的關系最遠（圖4）。

2.3 ?MiNI基因相對表達分析

以花后10 d MiNI基因表達量為對照（由于此時新生芒果直徑不足2 mm，無法將果皮果肉分開，所以圖5中10 d的基因表達量僅用一橫線柱表示），芒果果實不同發(fā)育階段MiNI基因的表達結果顯示，在果實的不同發(fā)育時期，MiNI基因的相對表達量存在顯著性差異。從花后10～40 d，MiNI基因表達量顯著下降，果皮和果肉Ct值達到0.4345和0.0289;花后40～100 d，果皮中基因表達量相對穩(wěn)定，無顯著差異，Ct值維持在0.4275～0.5001之間，而果肉表達量維持在一個更低的水平;直至130 d果實成熟度最高時，果皮表達量又顯著增高至0.7979，但此時果肉中MiNI基因表達量降低至最低水平，Ct值僅為0.0007。從圖5可看出，MiNI基因表達主要在果皮中，果肉中表達量很低，且果實發(fā)育各時期果皮內MiNI基因表達量均顯著高于果肉。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P<0.05）。

3 ?討論

本研究基于芒果轉錄組測序數據（SRP-035450）[12]，克隆了與NI基因高度同源的cDNA序列，測序結果與轉錄組數據庫序列一致，表明成功克隆了MiNI基因序列。蛋白結構保守域分析表明，芒果NI具有glycoside hydrolase family 100結構保守域，glycoside hydrolase family 100是糖苷水解酶的一個家族，糖苷水解酶主要功能為水解碳水化合物的糖苷鍵，AI和NI均屬于糖苷水解酶家族100成員[13-14]。同時，本研究通過MEME在線網站分析預測了NI 10個Motif位點，結果表明芒果、克里曼丁桔、龍眼、巴西橡膠樹和番木瓜具有一致的Motif位點，根據結構相似功能相似的原理，也可證實成功克隆了MiNI基因。本研究對MiNI基因進行了包括同源性分析、保守結構域分析、Motif位點分析和進化分析在內的較為全面的生物信息學分析，結果表明，MiNI基因與其它植物NI基因相似性很高，進化較為保守。

qRT-PCR分析結果顯示，從花后40 d至果實發(fā)育后期，果皮MiNI基因表達量始終高于果肉，這與王婷婷等[15]的研究結果一致，而關于果皮和果肉中NI酶活性和蔗糖、果糖、葡萄糖含量的測定也將是今后研究的內容，研究結果將有利于闡明果皮果肉在糖代謝過程中的地位和作用;另一方面，武紅霞等[7]關于‘臺農1號芒果的研究結果表明，整個果實發(fā)育期間，果肉NI酶活性變化不大，處于相對穩(wěn)定水平，這與本研究中果肉MiNI基因表達量相對穩(wěn)定，始終處于較低水平的結果也是相符的。Gao等[16]研究表明，NI基因的表達量與NI活性呈顯著正相關，Joubert等[17]通過轉化反義NI基因至甘蔗，懸浮培養(yǎng)14 d，發(fā)現細胞中NI活性顯著降低，使得蔗糖濃度顯著增加，己糖含量明顯降低，這表明NI基因在糖代謝途徑發(fā)揮了重要作用。另一方面，桃果實研究結果暗示NI基因可能在糖代謝中發(fā)揮著調節(jié)作用[18]。綜上所述，NI基因在植物發(fā)育過程中起重要作用，為分析該基因在芒果蔗糖代謝途徑中的作用和利用分子生物學手段調控NI基因的表達，進而改變果實糖含量和改良果實品質奠定基礎。

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