南川百合種子萌發(fā)及組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

張梅 張杰 王強

摘 要：研究不同溫度以及不同濃度赤霉素對南川百合種子萌發(fā)的影響，并以南川百合的鱗片和葉片作為外植體探究南川百合組培快繁技術(shù)，探究無機鹽濃度對南川百合外植體分化的影響。結(jié)果表明：處理條件為16℃加200mg·L-1赤霉素時南川百合種子萌發(fā)率最高，萌發(fā)速度也最快，溫度對南川百合種子萌發(fā)率的影響具有顯著性;當(dāng)用南川百合的鱗片作為外植體時，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA為最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，無機鹽和有機物濃度高鱗片外植體分化率也較高;當(dāng)用南川百合葉片作為外植體時，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA為最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，無機鹽和有機物濃度越高外植體分化率越低。

關(guān)鍵詞：南川百合;種子萌發(fā);組織培養(yǎng);外植體

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930047

南川百合（Lilium rosthornii Diels）為百合科百合屬多年生草本植物，是我國特有的原生百合之一，具有較高的園藝觀賞價值和一定藥用價值。由于南川百合對生長環(huán)境的要求比較苛刻，加之人為采挖比較嚴(yán)重，目前野生南川百合種質(zhì)資源急劇減少甚至在一些分布區(qū)已經(jīng)絕跡[1]，因此對于南川百合的生長繁育進行研究十分有必要。

目前，國內(nèi)關(guān)于南川百合種子萌發(fā)特性的報道較少[2，3]，關(guān)于南川百合組織培養(yǎng)的研究通常以鱗片為外植體，聚焦于研究激素配比和有機添加物對誘導(dǎo)分化的影響[4-8]。本文通過試驗探究溫度和赤霉素對南川百合種子萌發(fā)的影響，以鱗片和葉片為外植體研究南川百合組培快繁條件，特別研究了無機鹽和有機物濃度對南川百合外植體分化的影響，對促進南川百合人工繁育技術(shù)有一定參考意義。

1 試驗與方法

1.1 試驗材料

南川百合引種自湖北宜昌，栽培于阿壩師范學(xué)院花卉繁育基地;種子為頭年采收種子，選取飽滿、大小相近的種子進行實驗;鱗片選取飽滿無病蟲害的鱗片，葉片選取植株較上端的幼嫩無病害葉片。實驗中所用無機鹽和蔗糖均為AR級，其它有機物和植物生長調(diào)節(jié)劑為BR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度和GA3對南川百合種子萌發(fā)的影響

選取顆粒飽滿大小均勻的種子，裝入尼龍網(wǎng)袋，用流水沖洗20min，將種子分為5組，分別放置于0mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、150mg·L-1及200mg·L-1的GA3溶液中浸泡6h。浸泡完成后，將種子平鋪于無菌蒸餾水潤濕的滅菌濾紙上，放到玻璃培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。4臺人工氣候箱的溫度分別設(shè)為16℃、19℃、22℃和25℃，濕度為75%，光照強度為2600Lx，光照時長為12h·d-1;每個氣候箱都包含5種GA3處理條件的種子，每個條件以20粒種子為1組。每3d觀察1次，胚根露出種皮后，每天觀察1次，做好數(shù)據(jù)記錄。

1.2.2 鱗片外植體的初代培養(yǎng)

取鱗莖中外層飽滿健康鱗片，沖洗凈泥土，用含少量洗衣粉溶液浸泡10min，用自來水沖洗20min備用;外植體消毒條件為75%乙醇浸泡30s后，再放入0.1%的升汞溶液浸泡8min，接著用無菌水沖洗5～6次;將消毒后的鱗片切成邊長0.5～1cm的方塊接種到初代培養(yǎng)基上，初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，pH為5.6～6.0，以NAA和6-BA為誘導(dǎo)分化激素，設(shè)計試驗見表1。接種完成后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強度1500～2000Lx，光照時間12h·d-1，溫度為25±2℃。

1.2.3 無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響

為探究無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響，分別以MS，1/2MS，1/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，以鱗片外植體初代培養(yǎng)實驗所確定的具有最佳誘導(dǎo)分化效果的激素配比作為激素處理條件，外植體消毒及接種后的培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 葉片外植體的初代培養(yǎng)

取南川百合植株上部幼嫩無病害葉片，在流水下沖洗20min，然后于超凈工作臺用75%乙醇浸泡8s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞溶液浸泡5min，最后用無菌水清洗5～6次，每次2～3min，將消毒好的葉片放在無菌濾紙上吸干表面的水分，用手術(shù)刀切割為大約1cm×1cm的小塊接種到培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，激素添加情況如表2所示。每個處理條件接種30塊外植體，培養(yǎng)條件同鱗片外植體初代培養(yǎng)。

1.2.5 無機鹽和有機物濃度對葉片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖濃度為40g·L-1，瓊脂為8g·L-1，以葉片外植體初代培養(yǎng)實驗所確定的具有最佳誘導(dǎo)分化效果的激素配比作為激素處理條件，外植體消毒及接種后的培養(yǎng)條件同葉片外植體的初代培養(yǎng)。

1.2.6 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)采用趙靜確定的培養(yǎng)條件1/2MS加10.0mg·L-1PP333加0.5mg·L-1NAA[5]。

1.2.7 組培苗的移栽煉化

待組培苗長至3～4cm高時，將培養(yǎng)瓶置于室內(nèi)無陽光直射處煉苗7d，然后擰松瓶蓋培養(yǎng)2d，再完全揭去瓶蓋于室內(nèi)靜置3d，使組培苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，最后將組培苗從培養(yǎng)瓶移出，小心洗凈根部瓊脂，種植于培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)基質(zhì)配比為田園土∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度及GA3對南川百合種子萌發(fā)的影響

按照前述方法，將GA3處理好的種子置于不同溫度人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)35d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表3所示。從表3可知，南川百合種子萌發(fā)率最高的處理組合為200mg·L-1GA3浸泡6h加16℃恒溫培養(yǎng)，在該條件下種子萌發(fā)率為70%，開始萌發(fā)時間最短，僅為13d。用SPSS25對實驗結(jié)果做方差分析和多重比較，結(jié)果表明，在顯著性水平為0.05情況下，GA3處理對南川百合種子萌發(fā)沒有顯著影響，溫度對南川百合種子萌發(fā)的影響具有顯著性，溫度的F值為7.378，最適南川百合種子萌發(fā)的溫度為16℃。

2.2 鱗片外植體的初代培養(yǎng)

南川百合鱗片外植體初代培養(yǎng)30d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表4。從表4可知，在MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下鱗片外植體有最高的分化率為46.67%。

2.3無機鹽和有機物濃度對鱗片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基另外添加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，誘導(dǎo)南川百合鱗片外植體分化產(chǎn)生不定芽，培養(yǎng)30d后結(jié)果如表5所示。從表5可知，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)培養(yǎng)條件有最高的分化出芽率，1/4MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA分化出芽率最低;并且MS培養(yǎng)基上生長的不定芽株形正常、長勢更佳、葉片更綠，而1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上生長的不定芽生長更慢，葉片易發(fā)黃枯萎（如圖1所示）。由此可見，較高的無機鹽和有機物濃度有利于南川百合鱗片外植體分化產(chǎn)生不定芽，也有利于不定芽生長發(fā)育。

2.4 葉片外植體的初代培養(yǎng)

按前述試驗設(shè)計接種南川百合葉片外植體，培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計的試驗結(jié)果見表6。從表6可知，在MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下，南川百合的葉片外植體有最高的愈傷組織分化率，分化率達60%;當(dāng)培養(yǎng)基6-BA濃度達2.0mg·L-1時，對南川百合葉片外植體的分化有明顯的抑制作用;在不添加外源激素的培養(yǎng)條件下，葉片外植體也基本不分化。將試驗數(shù)據(jù)用SPSS25進行方差分析和多重比較，結(jié)果表明，在顯著性水平為0.05情況下，6-BA對南川百合葉片外植體的分化具有顯著影響，F(xiàn)值為11.139，6-BA濃度為1.0mg·L-1時最有利于葉片外植體的分化，與其它培養(yǎng)條件相比具有顯著差異。

2.5 無機鹽和有機物濃度對葉片外植體分化的影響

以MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基另外添加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，誘導(dǎo)南川百合葉片外植體分化產(chǎn)生不定芽，培養(yǎng)30d后結(jié)果如表7所示。從表7可知，1/4MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件最有利于南川百合葉片外植體分化不定芽，其不定芽分化率為26.67%，而MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下葉片分化率最低，表現(xiàn)出低濃度的無機鹽和有機物水平有利于南川百合葉片外植體的分化，這與鱗片外植體的情況剛好相反。從圖2可知，培養(yǎng)30d后在MS培養(yǎng)基上多數(shù)葉片外植體已經(jīng)壞死，有少量外植體分化出小小的芽點。而此時，在1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上的不定芽已經(jīng)生長到2～4cm高，部分在1/4MS培養(yǎng)基上生長的不定芽已經(jīng)分化出根。

2.6 組培苗的煉化栽培

以前述方法進行組培苗的煉化移栽，30d后統(tǒng)計成活率，成活率達91.4%。

3 分析與展望

試驗表明，較低的溫度有利于南川百合種子的萌發(fā)，而GA3的處理對南川百合種子的萌發(fā)則沒有表現(xiàn)出明顯的促進作用，南川百合種子萌發(fā)不需要黑暗的條件，但黑暗環(huán)境和光照環(huán)境誰更有利于南川百合種子萌發(fā)還有待進一步研究?？傮w來看，南川百合種子萌發(fā)不存在困難，播種繁殖是南川百合一條有效繁殖途徑。

和多數(shù)野生百合一樣，南川百合的鱗片外植體也是比較容易分化的，但有試驗表明，南川百合的葉片外植體分化比較困難[5]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件比較有利于南川百合葉片外植體的分化，特別是1.0mg·L-16-BA對南川百合葉片外植體分化有明顯的促進作用，但在MS培養(yǎng)基上葉片外植體分化出的多數(shù)為愈傷組織，要經(jīng)過較長時間生長才有少量愈傷組織開始分化不定芽。同時也發(fā)現(xiàn)較高濃度的6-BA會明顯抑制南川百合葉片外植體的分化，在2.0mg·L-16-BA的培養(yǎng)條件下沒有發(fā)現(xiàn)一份葉片外植體分化，培養(yǎng)一段時間都枯萎死亡，所以在誘導(dǎo)南川百合葉片外植體分化的實驗中，6-BA的濃度是一個關(guān)鍵的因素，但相關(guān)機理還有待進一步探索。

在研究無機鹽和有機物濃度對南川百合外植體分化的影響時，發(fā)現(xiàn)較高濃度的無機鹽和有機物（如MS培養(yǎng)基）有利于南川百合鱗片外植體分化產(chǎn)生不定芽，而較低濃度的無機鹽和有機物（如1/4MS培養(yǎng)基）有利于南川百合葉片外植體分化產(chǎn)生不定芽。在已有的報道中，百合葉片外植體的分化往往是比較困難的，但是卻很少試驗1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基對葉片分化不定芽的影響，1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基通常用于和生根培養(yǎng)有關(guān)的試驗中。從本文試驗來看，較低濃度的無機鹽和有機物有利于南川百合葉片分化不定芽，對于其它種類的野生百合是否也存在這樣的現(xiàn)象是非常值得進行研究的。

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（責(zé)任編輯 ?周康）