不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合消毒方式及培養(yǎng)基蔗糖濃度對(duì)梭砂貝母愈傷組織誘導(dǎo)的影響

歐珠朗杰 賀凱 米瑪潘多

摘 要：以梭砂貝母鱗莖為外植體，研究梭砂貝母組織培養(yǎng)中植物不同生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合、外植體不同消毒方式及培養(yǎng)基蔗糖濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果比較。結(jié)果表明，適宜誘導(dǎo)梭砂貝母鱗莖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度為6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養(yǎng)基，用75%的乙醇消毒外植體30s，再用0.1%的升汞消毒10min污染率較低，蔗糖濃度為3%時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，結(jié)構(gòu)結(jié)實(shí)、顏色淡黃且褐化率低。

關(guān)鍵詞：梭砂貝母;外植體;愈傷組織;植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930007

引言

梭砂貝母（Fritillaria delavayi Franch.）屬百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria），藏語為阿皮卡，是白合科多年生草本植物，地下鱗莖外表類白色或淺黃棕色，部分具零星棕色斑點(diǎn)[1]。在西藏海拔4100m以上的高山流石灘均有出產(chǎn)，云南西北部、四川西部、青海南部（雜多、囊謙）也有出產(chǎn)。為重要的藏藥材，用于陰虛勞嗽、肺熱燥咳，干咳少痰，具有潤肺清熱，化痰功效[1]。由于梭砂貝母藥用價(jià)值高，而其生長環(huán)境特殊、分布分散，自然繁殖系數(shù)低，商品藥材完全依靠采挖野生資源并連年過度采挖，導(dǎo)致資源日趨減少，面臨枯竭危險(xiǎn)，破壞了梭砂貝母生長環(huán)境、種群自然更新，使梭砂貝母資源陷入?yún)T乏。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)人工擴(kuò)繁梭砂貝母資源，可不受季節(jié)、地域的影響，后代遺傳性能穩(wěn)定，具有很大的發(fā)展前景和極其重要的實(shí)際意義。目前，國內(nèi)外對(duì)梭砂貝母的研究主要集中在化學(xué)成分、藥效方面，對(duì)其栽培技術(shù)方面的研究相對(duì)較少，尚無針對(duì)梭砂貝母的較成熟組培技術(shù)參數(shù)[2]。本文通過人工條件下組織培養(yǎng)梭砂貝母，從梭砂貝母不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及組合配比、不同消毒方式、培養(yǎng)基蔗糖濃度等方面探究梭砂貝母培養(yǎng)技術(shù)并進(jìn)行分析，得出相關(guān)技術(shù)參數(shù)，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為2020年7月采集于西藏山南市扎囊縣境內(nèi)，生長于海拔4650m的高山流石灘的梭砂貝母的鱗莖。從其鱗莖中選取無病害乳白色鱗莖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室無菌處理，將切成適宜大小的鱗莖小塊，接種于不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合濃度的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行調(diào)控培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及母液的配制

以MS培養(yǎng)基（大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)）為基本培養(yǎng)基分別加入2%、3%、4%的蔗糖和7g·L-1的瓊脂，pH值調(diào)至5.8，攪拌均勻，添加不同濃度的2， 4-D，6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）激素，分裝于培養(yǎng)瓶。

2， 4-D、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6-BA）等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，分別配成母液（0.1mg·mL-1）。配制方法：分別稱取2， 4-D、6-BA和NAA各10mg，將NAA用少量（1mL）無水乙醇預(yù)溶，將6-BA用少量（1mL）物質(zhì)的量濃度為0.1mol·L-1的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最后分別定容至100mL，即得質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的母液[3]。

1.2.2 外植體的處理

組培用梭砂貝母鱗莖取自自然生境，外植體內(nèi)外附有大量的微生物，外植體能否有效消毒是組織培養(yǎng)成功與否的重要影響因素[4]。消毒要求把材料表面和組織內(nèi)的各種微生物殺滅干凈，只輕微損傷甚至不損傷組織材料而達(dá)到不影響外植體組織活力的目的[4]。

選取梭砂貝母地下鱗莖先用流水沖洗1h以上，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3種不同的消毒方式（表1），用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙將外植體表面的水吸干，將其切成0.5cm，厚度為0.2cm左右大小相近的小塊，接種到培養(yǎng)基上。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

根據(jù)外植體消毒處理結(jié)果，選擇消毒效果良好的消毒方法，將梭砂貝母適宜大小鱗莖小塊接種在附加不同濃度AA、2， 4-D、BA組合及不同濃度蔗糖培養(yǎng)基上，設(shè)蔗糖濃度為2%、3%、4%的培養(yǎng)基，比較蔗糖和植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)梭砂貝母愈傷組織生長的影響[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體污染的影響

從表1可以看出，僅用75%乙醇消毒30s的外植體污染率最高;75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒10in次之;用75乙醇消毒材料30s，再用0.1%的升汞消毒20min的外植體污染率最低。

3種消毒方法中，第1種方法污染率最高，第3種消毒方法污染率最低，但第3種消毒方法使鱗莖褐變率達(dá)90%以上。因此，第2種消毒方法較適合鱗莖的消毒。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)過程中外植體脫分化形成愈傷組織的關(guān)鍵因素，形成愈傷組織的量和質(zhì)量由培養(yǎng)基中不同植物生長調(diào)節(jié)劑的相對(duì)濃度控制，而不是這些物質(zhì)的絕對(duì)濃度決定[5]。采用上述第2種消毒方法消毒的梭砂貝母鱗莖接種于附加2， 4-D，6-BA，NAA的6種培養(yǎng)基。結(jié)果（表2）表明，在6-BA 0.5mg·L-1加2， 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養(yǎng)基對(duì)鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)率最高，均達(dá)到75%。

2.3 蔗糖濃度對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取相同適宜消毒方法和植物生調(diào)節(jié)劑濃度組合的培養(yǎng)基，其蔗糖濃度為3%時(shí)，外植體愈傷組織誘導(dǎo)率較高（表3）;蔗糖濃度為2%、2.5%、3.5%、4%時(shí)，外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均較低;其中4%時(shí)外植體愈傷組織誘導(dǎo)率最低，可見誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基較適宜的蔗糖濃度為3%。

3 結(jié)論

在本研究中，以梭砂貝母鱗莖作為外植體，分別研究適宜誘導(dǎo)愈傷組織的外植體消毒劑濃度、培養(yǎng)基蔗糖濃度及植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有一定程度的影響，蔗糖濃度為3%時(shí)，外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率較高;較低（2%）或較高（4%）均抑制外植體脫分化形成愈傷組織。較低或較高的蔗糖濃度使愈傷組織呈透明或淡黃色水澤狀，結(jié)構(gòu)硬板，形成量小，易褐化死亡，不利于進(jìn)一步轉(zhuǎn)接繁殖、分化和成苗[6]。誘導(dǎo)愈傷組織2種較好的培養(yǎng)基分別是MS加6-BA 0.5mg·L-1加2， 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1。可為今后克服梭砂貝母組培與擴(kuò)繁試驗(yàn)的盲目性，節(jié)約人力、物力、財(cái)力提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 歐珠朗杰.藏藥材——梭砂貝母組織培養(yǎng)研究[J].西藏科技，2012（09）：72-73.

[2]馬吉義.暗紫貝母組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究[D].西寧：青海師范大學(xué)，2011.

[3]歐珠朗杰，米瑪潘多.梭砂貝母鱗莖組織培養(yǎng)研究[J].南方農(nóng)業(yè)，2019，13（27）：129-130.

[4]張志良，戳偉青.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2002.

[5]唐進(jìn)，汪發(fā)纘.中國植物志[M].第14卷.北京：科學(xué)出版社，1980：104-105.

[6]蔡朝暉，李萍，高山林.中藥貝母的組織培養(yǎng)研究狀況[J].中草藥，1998，29（04）：272-178.

（責(zé)任編輯 ?李媛媛）