關(guān)嶺牛多種寄生蟲混合感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷與治療

徐 雨， 馮明祥， 韋登雄， 圖 雅， 劉 蘋， 楊和俊， 陳永翠

(貴州省關(guān)嶺布依族苗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 關(guān)嶺 561300)

寄生蟲病是牛的三大疾病之一，常見的牛寄生蟲有線蟲、吸蟲、絳蟲、球蟲和血液原蟲等。動(dòng)物感染寄生蟲后多呈慢性消耗性經(jīng)過，臨床表現(xiàn)為消瘦、水腫、貧血、便秘下痢交替發(fā)生，最后因惡病質(zhì)而死亡，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。2020年4月，關(guān)嶺布依族苗族自治縣某聯(lián)保戶養(yǎng)殖關(guān)嶺牛3頭，出現(xiàn)不明原因消瘦，被毛凌亂，排茶色尿，疑似寄生蟲感染。為查明原因，對(duì)牛進(jìn)行采樣檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行針對(duì)性治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)病料采集3頭牛的糞便、血液(頸靜脈采集全血，-20 ℃凍存)各1份。

1.1.2 主要試劑與儀器尼龍兜(60目和120目)、玻片、染色缸、生物顯微鏡、無菌采血管；吉姆薩染色試劑(Solarbio)、2×TaqMaster Mix試劑(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、瓊脂糖粉(Amresco)、D 5000 DNA Ladder(Biomiga)、GoldView核酸染料(Solarbio)、天根DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 蟲卵檢查按照尼龍兜集卵法[4，5]收集蟲卵后，顯微鏡檢查蟲卵形態(tài)、大小，鑒定蟲卵種類。

1.2.2 血液原蟲檢查制作血液推片，自然干燥后甲醇固定5 min，10%吉姆薩染色，24 h后清水沖洗，晾干鏡檢[6]。

1.2.3 血液原蟲PCR鑒定按照GenBank發(fā)表的相關(guān)血液原蟲序列設(shè)計(jì)引物，雙芽巴貝斯蟲引物參照相關(guān)文獻(xiàn)[6，7](見表1)。

表1 引物序列

將采集的3份血液分別標(biāo)記為1～3號(hào)，用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。附紅細(xì)胞體和雙芽巴貝斯蟲檢測(cè)選用同一反應(yīng)體系。反應(yīng)體系10 μL：2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，DNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變 性 30 s，60 ℃ 退 火30 s，72 ℃ 延 伸60 s，共 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，并送生工生物公司測(cè)序。

1.2.4 治療根據(jù)檢測(cè)結(jié)果明確牛感染寄生蟲種類后，選取針對(duì)性藥物進(jìn)行治療，并于14 d后再次進(jìn)行寄生蟲檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 蟲卵檢查在糞便中檢查到線蟲卵(長徑90 μm，寬徑40 μm左右)和吸蟲卵(長徑150 μm，寬徑80 μm左右)，見圖1。未檢出絳蟲卵和球蟲卵囊。

a：線蟲卵 b：線蟲卵 c：吸蟲卵圖1 蟲卵鏡檢結(jié)果(10×40)

2.2 血推片檢查染色鏡檢可見紅細(xì)胞內(nèi)含2個(gè)紫色點(diǎn)狀蟲體，疑似雙芽巴貝斯蟲(見圖2)。

圖2 血推片染色鏡檢結(jié)果(10×100)

2.3 血液原蟲PCR鑒定由圖3可見：1號(hào)血液樣品附紅細(xì)胞體呈陽性，PCR擴(kuò)增條帶為800 bp左右；1～3號(hào)血液樣品雙芽巴貝斯蟲呈陽性，PCR擴(kuò)增條帶為1 800 bp左右。陽性產(chǎn)物送生工生物公司測(cè)序確定為附紅細(xì)胞體和雙芽巴貝斯蟲。

3 結(jié)論

通過糞便蟲卵檢查、血推片檢查和血液原蟲PCR鑒定，診斷患病牛為線蟲、吸蟲、附紅細(xì)胞體、雙芽巴貝斯蟲混合感染。

M：5 000 DNA Marker； 1～3：各樣品附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)；4～6：各樣品雙芽巴貝斯蟲PCR檢測(cè)圖3 血液原蟲PCR檢測(cè)結(jié)果

4 治療

(1)血液原蟲：貝尼爾(血蟲凈)5 mg/kg體重，用滅菌蒸餾水配成5%溶液，臀部深層肌肉注射，間隔48 h 后再注射1次。用0.5%敵百蟲噴灑牛體和圈舍，15 d后再次噴灑。(2)線蟲和吸蟲：氯氰碘柳胺鈉注射液2.5 mg/kg體重，皮下(或肌肉)注射(肌注藥物間隔3 d分開使用)。14 d后再次采集糞便和血液，未檢測(cè)到相應(yīng)蟲卵、蟲體。

5 討論

該養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的3頭牛長期消瘦，被毛凌亂，從未進(jìn)行過驅(qū)蟲，并一直放牧飼養(yǎng)，加上春季是寄生蟲病高發(fā)時(shí)期，導(dǎo)致多種寄生蟲混合感染。線蟲、吸蟲是牛消化道的主要寄生蟲，在宿主體內(nèi)長期掠奪營養(yǎng)，導(dǎo)致消瘦，并對(duì)消化道造成機(jī)械性損傷。血液原蟲病破壞紅細(xì)胞，造成貧血、黃疸、茶色尿等明顯臨床癥狀，同樣長期攝取寄主能量，影響生長。經(jīng)針對(duì)性用藥治療后，復(fù)查未見蟲體，2個(gè)月后牛生長恢復(fù)正常，證明治療藥物有效。