安順市平壩區(qū)2020年春季散養(yǎng)戶豬O型口蹄疫免疫抗體監(jiān)測分析

班榮香

(貴州省安順市平壩區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 平壩 561100)

口蹄疫(Foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動物的1種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床癥狀以蹄部水皰為典型特征，發(fā)病急，傳播迅速。該病除通過感染的動物及排泄物傳播外，還能以氣溶膠的形式通過空氣遠(yuǎn)距離傳播。哺乳仔豬發(fā)病多呈急性胃腸炎和心肌炎，突然死亡，病死率可達(dá)100%[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為15個A類動物疫病名單之首；我國也將其排在一類動物疫病的第1位，并規(guī)定所有生豬實行強制免疫[2，3]。平壩區(qū)用于免疫生豬的口蹄疫疫苗為O型口蹄疫合成肽疫苗，每年集中免疫時間為春、秋兩季，平時采取隨進(jìn)隨補的補免政策，最大限度保障平壩區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前生豬散養(yǎng)戶占平壩區(qū)生豬養(yǎng)殖總量的30%左右，在平壩區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)中起著舉足輕重的作用。

本次檢測對平壩區(qū)9個鄉(xiāng)鎮(zhèn)送檢的164份豬血清樣品采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)，分析豬O型口蹄疫合成肽苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫抗體水平及免疫效果，為區(qū)域疫情預(yù)警、免疫防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗豬O型口蹄疫合成肽疫苗(多肽TC98+7309+TC07)，購自新疆天康生物技術(shù)股份有限公司(批號2019017)。

1.1.2 血清樣品來源于平壩區(qū)9個鄉(xiāng)鎮(zhèn)82個村免疫豬O型口蹄疫合成肽疫苗的散養(yǎng)戶生豬，免疫28 d后采集豬血清樣品，每村采集2頭份，共164份。

1.1.3 主要試劑豬O型口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體iELISA檢測試劑盒，購自無錫優(yōu)聯(lián)生物科技有限公司(批號191010)。

1.1.4 主要儀器普通離心機(TG16B)、酶標(biāo)儀(DNM-9606)、微型振蕩器(PR-WZT-2)、恒溫培養(yǎng)箱(PR-BYX-9082)。

1.2 方法

1.2.1 疫苗接種春防期間各村動物防疫員統(tǒng)一對轄區(qū)村寨的生豬散養(yǎng)戶進(jìn)行豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫，按照說明書進(jìn)行豬耳根后肌肉注射，每頭豬注射1 mL。平壩區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心進(jìn)行入村入戶防疫督查，以確保防疫工作真實有效地開展。

1.2.2 血清樣品采集免疫工作結(jié)束以后28 d，在鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)干部的指導(dǎo)下，各村動物防疫員參與，用一次性采血器隨機到各村采集免疫生豬的全血樣品，每村2頭份。然后統(tǒng)一用普通離心機1 500 r/min 離心5 min分離血清，分裝于1.5 mL EP管中，并在每份血清樣品上標(biāo)注樣品信息編號。

1.2.3 血清免疫抗體檢測按照豬O型口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體iELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行。(1)血清稀釋：對照血清進(jìn)行1∶4稀釋，待檢血清進(jìn)行1∶40稀釋。(2)洗滌抗原包被板：洗滌液按照1∶20倍稀釋進(jìn)行配制，根據(jù)檢測樣品數(shù)量取出對應(yīng)的檢測板條共計172孔，每孔加入稀釋好的工作洗滌液200 μL，重復(fù)洗板2次，最后1次在吸水材料上拍干。(3)加陰性、陽性對照血清：陰性、陽性對照各設(shè)2孔，每孔加入對照血清100 μL。(4)加待檢血清：每份待檢血清樣品設(shè)立1孔，每孔加入待檢血清100 μL。(5)振勻：將反應(yīng)板放置于微型振蕩器上輕輕振蕩混勻。(6)溫育：反應(yīng)板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱溫育30 min。(7)洗板：甩掉孔中的反應(yīng)液，每孔加入稀釋好的工作洗滌液 200 μL，重復(fù)洗板5次，最后1次在吸水材料上拍干。(8)加酶標(biāo)二抗：每孔加入酶標(biāo)二抗100 μL。(9)二次溫育：反應(yīng)板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min。(10)再次洗板：甩掉孔中的反應(yīng)液，每孔加入稀釋好的工作洗滌液200 μL，重復(fù)洗板5次，最后1次在吸水材料上拍干。(11)加顯色液：每孔先加入顯色液A 50 μL，再加入顯色液B 50 μL。(12)避光顯色：輕輕振蕩混勻后，置于室溫下避光顯色10 min。(13)加終止液：每孔加入終止液50 μL。(14)結(jié)果檢測：在酶標(biāo)儀上測定各孔D630 nm值。

試驗過程中要注意幾點：試驗用的血清必須清亮無溶血；使用血清前最好置于離心機上進(jìn)行瞬時離心，以避免打開血清管蓋時有血清樣品飛濺，造成不必要的污染；所有試劑及血清使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫(20～25 ℃)；實驗結(jié)束后所有試劑耗材進(jìn)行無害化處理。

1.2.4 結(jié)果判定

1.2.4.1 結(jié)果的有效性判定成立條件：陽性對照與陰性對照平均D630 nm值之差>0.5(本次試驗滿足成立條件)。

1.2.4.2 檢驗結(jié)果計算S/P=樣品D630 nm值/陽性對照平均D630 nm值

1.2.4.3 結(jié)果判定S/P≥0.20，樣品免疫抗體判為合格；S/P<0.20，樣品免疫抗體判為不合格。

2 結(jié)果

根據(jù)各樣品檢測結(jié)果：154份樣品免疫抗體合格，合格率93.9%；10份樣品免疫抗體不合格，不合格率6.1%(見表1、表2)。經(jīng)計算樣品D630 nm值離散度為0.947。

表1 各檢測樣品D630 nm值統(tǒng)計

表2 免疫抗體判定情況

3 結(jié)論與討論

3.1試驗結(jié)果顯示，平壩區(qū)散養(yǎng)生豬O型口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體合格率為93.9%，達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定≥70%的要求，說明O型口蹄疫合成肽苗能夠誘導(dǎo)生豬產(chǎn)生較高水平的O型口蹄疫免疫抗體，具有較好的免疫保護力。

3.2檢測樣品D630 nm值離散度(0.947)較大，說明各個體之間、各個鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的免疫抗體參差不齊。由于實驗室檢測均為同一人操作，且試劑為同一廠家、同一批號，可排除實驗室因素。分析抗體水平參差不齊的原因可能有以下幾點：一是各鄉(xiāng)鎮(zhèn)防疫人員技術(shù)水平不一，免疫劑量、注射方法掌握不一致；二是生豬個體之間的差異，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體水平各有高低；三是各鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集和保存血清情況不同，導(dǎo)致抗體水平不一[4]。

3.3目前我國對動物疫病防治采取“預(yù)防為主、防重于治”的原則，在臨床上疫苗免疫作為預(yù)防疫病的首選[5]。近年來平壩區(qū)高度重視養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，2020—2021年將大力實施建設(shè)年出欄40萬頭生豬產(chǎn)量、年屠宰加工生豬100萬頭的養(yǎng)殖生產(chǎn)項目。因此，生豬疫病的防控顯得尤為重要，特別是對豬口蹄疫等烈性傳染病更要加強防疫和凈化。

3.4本次檢測結(jié)果表明平壩區(qū)生豬使用O型口蹄疫合成肽苗免疫效果較好，建議以后繼續(xù)使用該疫苗。為了取得更好的免疫效果，減少個體之間的免疫水平差異，在今后的防疫工作中要做到以下幾點：一是從上至下要做好防疫實戰(zhàn)培訓(xùn)，區(qū)疫控中心培訓(xùn)好鄉(xiāng)鎮(zhèn)技術(shù)干部，加強鄉(xiāng)鎮(zhèn)技術(shù)干部的理論知識和實踐操作，鄉(xiāng)鎮(zhèn)技術(shù)干部再指導(dǎo)村級防疫員更好地開展防疫工作。二是各鄉(xiāng)鎮(zhèn)技術(shù)干部具體指導(dǎo)各村級防疫員時，一定要嚴(yán)格按照免疫規(guī)范和要求進(jìn)行。三是村級防疫員在開展免疫工作的過程中要保證疫苗的免疫劑量、免疫部位準(zhǔn)確，特別要按要求保護保存好疫苗，避免疫苗失效或效價降低。四是嚴(yán)格規(guī)范采樣：用一次性采血管采血后，要在室溫下傾斜放置；有離心機的放置30 min后置于離心機中經(jīng)1 500～2 000 r/min離心5 min，分離血清；沒有離心機的則在室溫下傾斜放置2～4 h(放置過程中一定要防止陽光暴曬)，待血清自然析出[6]。五是保證送檢血清樣品的質(zhì)量：血清要保證清亮無雜質(zhì)、無溶血。一旦血液中的紅細(xì)胞破裂產(chǎn)生溶血，將會影響血清中的抗體及檢測效價。