骨碎補(bǔ)馬鹿茸片毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

錢(qián)星文， 伍小妹， 譚轉(zhuǎn)換

(東方藥林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510515)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種骨骼系統(tǒng)疾病，多由骨量減少、骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨骼脆性增加、易于骨折等原因引起[1]。在人口壽命延長(zhǎng)、老年人口占比必然上升的情況下[2]，OP成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第3種常見(jiàn)多發(fā)的慢性疾病[3]，已成為一個(gè)全球性的問(wèn)題[4]。本文研究一種具有增加骨密度作用的中藥保健食品，來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)的名醫(yī)驗(yàn)方，主要用于增強(qiáng)骨密度，方中所用原料均在既是食品又是藥品的保健品名單中[5]，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片的安全性，為組方的安全使用提供依據(jù)。

1 材料和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片(中元片)，由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、山茱萸、馬鹿茸為原料，添加微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂、潤(rùn)濕劑聚維酮 K30制備而成，每日服用量為4.32 g/60 kg(體質(zhì)量，下同)，送檢樣品量為5.0 kg(為中試驗(yàn)證生產(chǎn)中的未添加輔料的中間產(chǎn)品，批號(hào)為20170503)，棕色粉末，相當(dāng)于成品樣品9.72 kg，樣品每日服用劑量為2.22 g/60 kg，東方藥林藥業(yè)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠和Wistar大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定。

1.3 儀器和試劑

XS6001S動(dòng)物秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GR85DA高壓滅菌鍋[致微(廈門(mén))儀器有限公司]；TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；VS-1300L-U超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)、OLYMPUS 顯微鏡(OLYMPUS公司)；AU480 全自動(dòng)生化分析儀(Beckmen Coulter公司)； XT-2000i五分類(lèi)血球計(jì)數(shù)儀(Sysmex公司)。

1.4 方法[6]

1.4.1 小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)(最大耐受量法，MTD法) 選用雌雄各半20只18～22 g SPF級(jí)昆明種小鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質(zhì)量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為0.20 mL/10 g的樣品溶液2次，時(shí)間間隔為6 h，給藥后連續(xù)觀察14 d。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4.2 大鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)(最大耐受量法) 選用雌雄各半20只180～220 g SPF級(jí)Wistar大鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質(zhì)量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為2.0 mL/100 g的樣品溶液2次，時(shí)間間隔為6 h，給藥后連續(xù)觀察14 d。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況，判斷受試物的急性毒性。

1.4.3 Ames實(shí)驗(yàn) 采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷害沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗(yàn)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)大鼠后制備的肝勻漿(S9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。受試物質(zhì)量濃度分別為50、10、2、0.4、0.08 mg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)0、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿6個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試物和0.5 mL S9混合液(當(dāng)需要代謝活化時(shí))，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每組均做3個(gè)平行樣。37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。若受試物的回變菌落數(shù)是空白對(duì)照菌落數(shù)2倍以上、具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者，判定為陽(yáng)性。整套實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)進(jìn)行1次。

1.4.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 采用間隔24 h 2次灌胃法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用雌雄各半的50只體質(zhì)量25～30 g小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只，以40 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照，腹腔注射給藥，給藥量為0.1 mL/10 g。實(shí)驗(yàn)組樣品劑量設(shè)定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，稱(chēng)取樣品加蒸餾水調(diào)配成濃度分別為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量為0.2 mL/10 g。于末次給樣品溶液6 h后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)算1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計(jì)，并用泊松分布方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算PCE/NCE(成熟紅細(xì)胞)比例。

1.4.5 小鼠睪丸染色體畸變實(shí)驗(yàn) 用25只體質(zhì)量25～30 g的性成熟小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只，陽(yáng)性對(duì)照組給予2.0 mg/kg劑量的絲裂霉素，給藥量為0.1 mL/10 g，每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)2 d。實(shí)驗(yàn)組樣品劑量設(shè)定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，取樣品加蒸餾水分別調(diào)配成濃度為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量均為0.2 mL/10 g，每日灌胃1次，連續(xù)5 d，于首次給予受試物后的第13天，5組動(dòng)物同時(shí)腹腔注射給予6 mg/kg劑量的秋水仙素1次，6 h后處死，取雙側(cè)睪丸制片，Giemsa染色，每組分析5只動(dòng)物的染色體，每只動(dòng)物分析100個(gè)中期相細(xì)胞，計(jì)算睪丸染色體畸變發(fā)生率(以百分率計(jì))。

1.4.6 亞急性毒性實(shí)驗(yàn) 選用體質(zhì)量60～80 g SPF級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為3個(gè)樣品組及對(duì)照品組，每組20只，樣品飼喂劑量設(shè)計(jì)為：0、0.93、1.85、3.70 g/kg(分別相當(dāng)于未去除輔料成品人擬用劑量的0倍、25倍、50倍、100倍)，動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由飲食。連續(xù)30 d觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束禁食16 h后，處死動(dòng)物并檢查實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量、血液指標(biāo)、生化指標(biāo)以及臟器及胸、腹腔大體病理變化。各組數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，14 d實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未見(jiàn)明顯的中毒表現(xiàn)和動(dòng)物死亡，各主要臟器亦未見(jiàn)異常，說(shuō)明受試物對(duì)兩種性別的大、小鼠的經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg，根據(jù)急性毒性分級(jí)，東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片屬無(wú)毒類(lèi)物質(zhì)。

2.2 Ames實(shí)驗(yàn)

樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過(guò)空白對(duì)照菌落數(shù)2倍；對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株實(shí)驗(yàn)菌株，加與不加S9，回變菌落數(shù)均未超過(guò)空白對(duì)照組菌落數(shù)的2倍，Ames實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，未出現(xiàn)基因突變情況。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

由表1可見(jiàn)，樣品各劑量組微核率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 小鼠睪丸染色體畸變實(shí)驗(yàn)

樣品各劑量組小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率均為0，與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而絲裂霉素陽(yáng)性對(duì)照組小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率為0.3%，與陰性對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片不會(huì)導(dǎo)致小鼠睪丸染色體畸變產(chǎn)生。

2.5 亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 一般情況觀察 以0.93、1.85、3.70 g/kg的劑量樣品飼料喂飼大鼠30 d期間，動(dòng)物未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，一般情況表現(xiàn)良好。各組隨機(jī)選取10只動(dòng)物的每周食物利用率、總食物利用率、體質(zhì)量和增重與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠的體質(zhì)量變化

圖2 實(shí)驗(yàn)期間大鼠每周的進(jìn)食量變化

圖3 實(shí)驗(yàn)期間大鼠每周食物利用率

2.5.2 受試物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 由表2、3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谘簩W(xué)的各項(xiàng)指標(biāo)中，僅雌性動(dòng)物中劑量組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，但均在本檢測(cè)單位正常值范圍內(nèi)。其余各劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.3 受試物對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響 由表4可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各項(xiàng)生化指標(biāo)均在本檢測(cè)單位正常值范圍內(nèi)，各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.4 受試物對(duì)大鼠臟器的影響 受試物各劑量組動(dòng)物的大體解剖檢查未發(fā)現(xiàn)異常和明顯病變，臟器質(zhì)量及臟體比值與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5、6)(P>0.05)。

2.5.5 組織學(xué)檢查結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行大體檢查，通過(guò)鏡下觀察高劑量組與對(duì)照組，未發(fā)現(xiàn)與樣品相關(guān)的病理組織學(xué)改變，因此，選擇高劑量組和對(duì)照組，進(jìn)行肝、腎、胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢的組織學(xué)檢查。個(gè)別受檢動(dòng)物，肝臟匯管區(qū)可見(jiàn)少量小圓形炎細(xì)胞浸潤(rùn)(對(duì)照組3/20，高劑量組2/20)、腎間質(zhì)可見(jiàn)少量小圓形炎細(xì)胞浸潤(rùn)(對(duì)照組1/20，高劑量組2/20)，但兩組2種病變例數(shù)之間無(wú)顯著性差異，提示所出現(xiàn)的病變與受試物無(wú)關(guān)，可能是動(dòng)物的自發(fā)病變。除此之外，胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢中均未見(jiàn)異常的病理改變，各劑量組動(dòng)物臟器均未發(fā)現(xiàn)由受試物引起的損害性改變。

圖4 實(shí)驗(yàn)期間大鼠的總增重、總進(jìn)食量、總食物利用率變化

表2 受試物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of test substance on hematological indexes in

表3 受試物對(duì)大鼠白細(xì)胞分類(lèi)的影響

表4 受試物對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響Table 4 Effect of test substance on blood biochemical indexes in

表5 受試物對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響

表6 受試物對(duì)大鼠臟體比的影響

3 討論

東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片對(duì)2種性別的大、小鼠最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg；3項(xiàng)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；30 d喂飼試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物體質(zhì)量、增重、食物利用率及臟體比值與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)均在本檢測(cè)單位正常值范圍內(nèi)；大體解剖未發(fā)現(xiàn)與受試樣品相關(guān)的病理組織學(xué)改變。綜上所述，本產(chǎn)品對(duì)大、小鼠細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)無(wú)致突變作用、無(wú)遺傳毒性和亞急性毒性，根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部相關(guān)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷，東方藥林牌骨碎補(bǔ)馬鹿茸片屬于無(wú)毒級(jí)，是一種食用安全的保健食品。

骨碎補(bǔ)馬鹿茸片以淫羊藿、骨碎補(bǔ)、山茱萸、馬鹿茸四味經(jīng)典的補(bǔ)腎中藥材為主要原料，研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成、抑制碎骨細(xì)胞的骨吸收的作用，能通過(guò)多種途徑防治骨質(zhì)疏松癥[7]。方中淫羊藿主要含有淫羊藿苷、總黃酮等生物活性成分[8]；淫羊藿治療股骨頭壞死具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其主要通路不僅直接參與骨重建的細(xì)胞增殖、凋亡及分化，調(diào)節(jié)成骨、破骨代謝平衡，還通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、炎癥及應(yīng)激反應(yīng)等干預(yù)和影響骨微環(huán)境以達(dá)到控制疾病發(fā)生發(fā)展的目的，與目前治療股骨頭壞死的作用機(jī)制相符合[9]。補(bǔ)骨脂活性成分主要有香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜酚類(lèi)等，是抗骨質(zhì)疏松的主要活性物質(zhì)，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)骨形成的作用[10-11]。山茱萸的現(xiàn)代研究顯示，山茱萸總苷可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織TRPV6、TRPV5、通道蛋白表達(dá)，改變TRPV6/TRPV5倍比關(guān)系，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，促進(jìn)成骨方向的骨代謝轉(zhuǎn)變及提高骨密度[12]。鹿茸具有骨生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)傷口愈合、組織修復(fù)，可能對(duì)股骨頭缺血性壞死具有治療作用，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示鹿茸粉能通過(guò)增加骨形成、改善脂肪代謝和增加血管形成來(lái)治療激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死[13]。以上內(nèi)容提示本產(chǎn)品具有改善骨質(zhì)疏松癥、增強(qiáng)骨密度的作用，本產(chǎn)品的研發(fā)順應(yīng)了人口老齡化的加劇、骨質(zhì)疏松癥多發(fā)的社會(huì)問(wèn)題現(xiàn)狀，和如今社會(huì)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的高度重視、藥物治療可能引起嚴(yán)重副作用、價(jià)格高等問(wèn)題，通過(guò)合理地?cái)z入增強(qiáng)骨密度功能食品來(lái)預(yù)防和延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展、促進(jìn)人體健康必不可少，可見(jiàn)本產(chǎn)品具有良好的開(kāi)發(fā)前景，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了產(chǎn)品的安全性，為本產(chǎn)品的增強(qiáng)骨密度的功效及作用研究提供良好基礎(chǔ)，加速其研發(fā)速度，以降低骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。本產(chǎn)品的研發(fā)理念為針對(duì)男女生理構(gòu)造和需要的不同而研發(fā)出男性專(zhuān)用的中元片和女性專(zhuān)用的欣月片，而要更好地確定本產(chǎn)品在增加骨密度、預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用靶點(diǎn)和對(duì)男女之間是否存在明顯區(qū)別，還需要更深入的研究和探索，為產(chǎn)品的更好應(yīng)用提供證據(jù)。