基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究抗601合劑的抗病毒抗炎作用機(jī)制

曾靜霞，周 維，姜彧騰，薛春玲*

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院急診/重癥醫(yī)學(xué)科，南京210008；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008）

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從整體上預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)、提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新興學(xué)科，具有整體性、系統(tǒng)性等特點(diǎn)，已廣泛用于篩選藥物活性成分、闡釋藥物作用機(jī)制、研究疾病發(fā)病機(jī)制等方面［1-2］。分子對(duì)接技術(shù)是通過受體或蛋白的特征及受體與藥物分子之間的相互作用方式來預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。

抗601合劑（Anti-601 Mixture）是由南京市兒童醫(yī)院根據(jù)兒童特點(diǎn)研制的經(jīng)江蘇省藥監(jiān)局批準(zhǔn)（蘇藥制字Z04000304）使用的自制中藥復(fù)方制劑，由黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花五味藥組成?？?01合劑具有清熱解毒、抗病毒、抗炎作用，由于療效確切、價(jià)格低，在兒童中使用廣泛，臨床廣泛用于病毒性肺炎、急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、扁桃體炎、腮腺炎等疾病，可改善患者的發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀，臨床應(yīng)用效果良好。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究抗601合劑抗病毒、抗炎的潛在作用機(jī)制，為藥物更廣泛應(yīng)用于臨床提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 抗601合劑中成分搜集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）［3］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），選擇“Herb name”，分別輸入“黃芪”“黃柏”“大黃”“板藍(lán)根”“金銀花”關(guān)鍵詞，檢索獲得抗601合劑中各味藥材所含的化學(xué)成分。

1.2 活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選

口服生物利用度（oral bioavailability，OB）指口服藥物的有效成分或活性基被胃腸道吸收，經(jīng)肝腎代謝，到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度，是藥物吸收、分布、代謝、排泄中最重要的參數(shù)之一，是評(píng)價(jià)藥物藥效的重要指標(biāo)。藥物的口服生物利用度低不僅導(dǎo)致個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)差異、血藥濃度波動(dòng)大，同時(shí)增加生產(chǎn)成本，增大機(jī)體毒性。從生物學(xué)角度看，類藥性（drug-likeness，DL）是藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性的總和，對(duì)于判斷中藥成分是否可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考價(jià)值。因抗601合劑為口服制劑，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中用OB≥30%和DL≥0.18篩選抗601合劑的活性成分，并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能收集抗601合劑中化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），限定物種為人，檢索得到所有靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因。

1.3 藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

先將化合物對(duì)應(yīng)的基因帶入蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái) STRING（https：//string-db.org/），獲取蛋白相互作用的關(guān)系。再將抗601合劑中藥材成分、化合物、靶點(diǎn)（基因）導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件（https：//cytoscape.org/）構(gòu)建“藥材－化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置節(jié)點(diǎn)連接度（degree）大于所有節(jié)點(diǎn)連接度中位數(shù)的2倍為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)通路分析

將所有化合物靶基因?qū)氲絎ebGestalt在線軟件（http：//webgestalt.org/）中進(jìn)行生物學(xué)過程和信號(hào)通路富集分析。進(jìn)行WebGestalt的基本參數(shù)選擇，Organism of Interest選擇對(duì)應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，Method of Interest選擇“ORA”，F(xiàn)untional Database分 別 選 擇“network+miRNA target”及“passway+KEGG”，點(diǎn)擊“submit”獲得通路富集結(jié)果。

1.5 成分－靶點(diǎn)分子對(duì)接

先從 RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidase synthase 2，PTGS2）的 3D 結(jié)構(gòu)pdb格式文件，運(yùn)用Discovery Studio 4.5 Client軟件去除PTGS2中的配體和水分子，再保存為pdb格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性化合物2D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用PyRx軟件進(jìn)行分子對(duì)接，先上傳去水加氫后的PTGS2受體文件，將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，再分別上傳配體化合物文件，將其能量最小化，并轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，運(yùn)用Vina進(jìn)行對(duì)接［4］。結(jié)合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，選擇結(jié)合能MODE、RSMD lower/upper bound為0的結(jié)合能為最佳結(jié)合能，表示構(gòu)象穩(wěn)定，發(fā)揮作用的可能性越大。最后運(yùn)用Discovery Studio 4.5 Client軟件進(jìn)行結(jié)果分析，輸出對(duì)接的png格式文件。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選

通過TCMSP檢索到黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花中化合物共724個(gè)，其中87個(gè)來自黃芪，140個(gè)來自黃柏，92個(gè)來自大黃，169個(gè)來自板藍(lán)根，236個(gè)來自金銀花。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18，剔除缺少靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的化合物，篩選出活性化合物151個(gè)，其中36個(gè)來自黃芪，37個(gè)來自黃柏，16個(gè)來自大黃，39個(gè)來自板藍(lán)根，23個(gè)來自金銀花。

2.2 藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

STRING分析平臺(tái)得出抗601合劑蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）（圖1）?！八幉模衔铮悬c(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)總共包括312個(gè)節(jié)點(diǎn)（5個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)，100個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、207個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1 478條邊，其中淡藍(lán)色圓形代表藥材，六邊形代表共有化合物，八邊形代表化合物，菱形代表靶點(diǎn)，虛線代表三者之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)連接度呈正比關(guān)系（圖2）。從圖中可看出抗601合劑中存在單個(gè)化合物與多靶點(diǎn)作用，不同化合物共同作用于同一靶點(diǎn)的現(xiàn)象，體現(xiàn)了中藥制劑多成分與多靶點(diǎn)協(xié)同作用的機(jī)制。本研究中，按連接度大于等于所有節(jié)點(diǎn)連接度中位數(shù)的2倍為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到藥材2個(gè)，成分46個(gè)，靶點(diǎn)81個(gè)。排名前10位的化合物分別是槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、木犀草素、刺槐黃素、漢黃芩素、黃芩素、異紫堇杷明和四氫小檗堿，其節(jié)點(diǎn)連接度分別為 252、140、96、52、51、40、38、30、25、23；排名前20位的靶點(diǎn)分別是PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A、AR、PRSS1、NOS2、ADRB2、RXRA、 ESR1、 KCNH2、 GABRA1、 ADRA1B、NCOA1、PGR、CHRM1、F7、CHRM3、CHEK1、PDE3A，節(jié)點(diǎn)連接度分別為91、75、57、48、42、36、36、33、32、28、27、24、23、22、22、20、18、18、17、17，為該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

2.3 抗601合劑中交集化合物

從藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)得出，抗601合劑不同的藥材里面存在相同的化合物，通過在線韋恩圖［5］（圖3）可知，β-谷甾醇為黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花所共有；豆甾醇為黃芪、黃柏、板藍(lán)根、金銀花共有；黃連堿為黃芪、黃柏共有；刺槐黃素及谷甾醇為黃芪、板藍(lán)根共有；黃烷酮為黃芪、金銀花共有；檞皮素為黃柏、金銀花共有；poriferast-5-en-3beta-ol為黃柏、板藍(lán)根共有。

2.4 靶點(diǎn)通路分析

功能富集分析得到GO條目717個(gè)（P≤0.05），其中生物過程（BP）條目240個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目240個(gè)，分子功能（MF）條目237個(gè)。結(jié)果見圖4。

KEGG通路富集分析得到209條信號(hào)通路（P≤0.05），排名前10位的通路包括糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end products and its receptor，AGE-RAGE）信號(hào)通路，IL-17信號(hào)通路，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路，鉑耐藥相關(guān)通路，以及前列腺癌、胰腺癌、乙型肝炎病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染等疾病相關(guān)通路（圖5）。其中抗病毒相關(guān)通路涉及乙型肝炎病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒和甲型流感病毒，涉及相關(guān)靶點(diǎn)基因及按照度排序依次為PTGS2、CASP3、BCL2、BAX、JUN、CASP8、CASP9、RELA、GSK3B、TP53、TNF、MAPK14、PRKCA、AKT1、CDKN1A；抗炎通路涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路，其相關(guān)靶點(diǎn)基因及按照度排序依次為PTGS2、CASP3、JUN、CASP8、RELA、GSK3B、TNF、MAPK14、AKT1。

2.5 抗601合劑核心化合物作用于PTGS2的分子對(duì)接

Figure 1 Protein interaction network of Anti-601 Mixture

分子對(duì)接結(jié)果顯示，將抗601合劑在藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中連接度超過中位數(shù)兩倍的10個(gè)核心活性化合物與PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接，與PTGS2結(jié)合能最低的化合物分別為豆甾醇（結(jié)合能為-40.6 kJ/mol）、槲皮素（結(jié)合能為-38.9 kJ/mol）、木犀草素（結(jié)合能為-38.5 kJ/mol）、刺槐黃素（結(jié)合能為-38.1 kJ/mol）、β-谷甾醇（結(jié)合能為-36.8 kJ/mol）、山柰酚（結(jié)合能為-36.8 kJ/mol）、黃芩素（結(jié)合能為-36.4 kJ/mol）、四氫小檗堿（結(jié)合能為-35.6 kJ/mol）、異紫堇杷明（結(jié)合能為-35.1 kJ/mol）、漢黃芩素（結(jié)合能為-33.5 kJ/mol）。各化合物按照結(jié)合能排序前5名的分子對(duì)接模式見圖6（受體中心不同顏色的小分子代表配體化合物，虛線代表氫鍵）。

3 討 論

抗601合劑臨床療效好，其中黃芩、金銀花二者配伍是抗病毒藥物的重要組成部分［6］，出現(xiàn)在2020年2月國家衛(wèi)健委頒布的新型冠狀病毒肺炎專家共識(shí)中［7］，對(duì)于抗擊新型冠狀病毒肺炎起到了良好的療效。因此本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)深入研究了抗601合劑的潛在作用機(jī)制。

Figure 5 Top 10 pathways for KEGG enrichment analysis of targets of Anti-601 Mixture

Figure 6 Molecular docking mode between PTGS2 and active compounds in Anti-601 MixtureA:Stigmasterol and PTGS2;B:Quercetin and PTGS2;C:Luteolin and PTGS2;D:Locust flavin and PTGS2;E:β-sitosterol and PTGS2;F:Kaempferol and PTGS2

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選得出抗601合劑的主要有效成分是槲皮素，其次為豆甾醇、β-谷甾醇、漢黃芩素、木犀草素等，這些化合物發(fā)揮抗病毒抗炎作用的主要作用靶點(diǎn)為PTGS2。通過分子對(duì)接技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)活性成分豆甾醇、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素與PTGS2結(jié)合能均小于0，可以自發(fā)結(jié)合，一般認(rèn)為當(dāng)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)揮作用的可能性越大，說明抗601合劑的核心化合物與主要靶點(diǎn)PTGS2親和力較高，是抗病毒抗炎機(jī)制的潛在基礎(chǔ)。

TNF參與全身炎性反應(yīng)，既促進(jìn)淋巴細(xì)胞的炎癥及免疫反應(yīng)，又促進(jìn)其他炎癥因子釋放［8］，其中TNF-α通過激活NF-κB發(fā)揮促炎作用，而NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，該通路的活化可誘導(dǎo)多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，且正反饋調(diào)節(jié)NF-κB的進(jìn)一步激活活化［9］。本研究KEGG通路富集分析，排在首位的是AGE-RAGE信號(hào)通路，該通路可激活NF-κB，引起促炎因子過表達(dá)與釋放，造成慢性細(xì)胞活化與組織損傷［10］?？?01合劑的作用機(jī)制也涉及到IL-17通路，Nrf2-IL-17D調(diào)控軸在感染過程中被激活，IL-1β、IL-6、PTGS2、TNF 均為 IL-17通 路的 重要媒介［11-12］。

文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素具有多種藥理作用，可以誘導(dǎo)TNF增強(qiáng) 2'，5'-低聚腺苷酸（2-5a）合成酶的作用，增強(qiáng)對(duì)腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）和單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）的抗病毒作用，從而增強(qiáng)IFN-β的生成［13］，通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，降低炎癥因子分泌［14-16］。另外，漢黃芩素能抑制流感病毒感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的生成［17］，具有明顯抗炎作用［18］，可通過激活Nrf2/AGE信號(hào)通路抑制IL-1β刺激引起的MAPK信號(hào)通路活化，從而抑制炎癥反應(yīng)［19］；漢黃芩素可以減少巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生，抑制NF-κB調(diào)控的炎性因子分泌，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［20］。木犀草素能抑制流感病毒增殖和炎癥因子表達(dá)，影響TLR信號(hào)通路，減輕病毒對(duì)宿主細(xì)胞的免疫損傷，發(fā)揮抗病毒作用［21］。β-谷甾醇可抑制 TNF-α 釋放與聚集［22］，豆甾醇能顯著降低炎癥因子PTGS2、IL-1β、IL-6和MCP-1的表達(dá)，顯示良好的抗炎活性［23］。此外，黃芩素既有抗病毒作用，也可通過抑制p38MAPK通路減弱SAP大鼠炎性反應(yīng)［24］。

綜上所述，抗601合劑的主要有效成分均具有一定的抗病毒、抑制炎癥作用，尤其對(duì)于皰疹病毒某些分型、甲型流感病毒、乙型肝炎病毒等有抗病毒作用。因此，推測(cè)槲皮素、豆甾醇等有效成分可能通過PTGS2靶點(diǎn)，參與影響AGE-RAGE、IL-17、TNF、NF-κB等信號(hào)通路，減少炎癥因子分泌，一定程度抑制病毒增殖，減輕病毒的免疫損傷，從而發(fā)揮抗病毒抗炎作用。

本研究亦有一定的局限性，對(duì)于有效成分和靶點(diǎn)基因之間的相互作用是直接作用還是間接作用無法判斷，且未考慮每種化合物具體含量，后期將對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)一步充分研究。