SLC13A5作為代謝性疾病潛在藥物作用靶點的研究進展

牛 群，孫秋爽，邱志霞，黃 芳*

（1中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理與中醫(yī)藥學(xué)系，南京211198；2中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝動力學(xué)研究中心，南京211198）

SLC13A5基因編碼的載體蛋白又被稱為質(zhì)膜檸檬酸轉(zhuǎn)運體/鈉離子依賴的檸檬酸轉(zhuǎn)運體（plasma membrane citrate transporter/Na+-citrate transporter，PMCT/NaCT），該載體蛋白位于上皮細胞質(zhì)膜上，是控制檸檬酸轉(zhuǎn)運的開關(guān)，負責將循環(huán)系統(tǒng)中的檸檬酸轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)。早期對于SLC13A5的研究主要集中在果蠅、秀麗隱桿線蟲等低等生物中，通過降低SLC13A5的表達，可顯著延長它們的壽命，其機制類似于熱量限制，該研究揭示了SLC13A5基因?qū)Υx過程的調(diào)控作用，因此SLC13A5也被稱為長壽基因（I’m not dead yet，INDY）［1］。在哺乳動物中，SLC13A5主要在肝臟中高度表達，在腎、睪丸和大腦中也有一定分布。研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、NAFLD、胰島素抵抗等患者中，其肝臟SLC13A5的表達都顯著升高［2］。而敲除SLC13A5基因的小鼠可以避免高脂飲食（high fat diet，HFD）誘導(dǎo)的上述代謝性疾病的發(fā)生［3］。由于檸檬酸水平與糖脂代謝的高度相關(guān)性，SLC13A5已經(jīng)成為調(diào)控能量代謝和脂質(zhì)代謝的理想靶點，許多針對SLC13A5設(shè)計的小分子抑制劑，在體內(nèi)外試驗中均可以抑制SLC13A5的表達，與在SLC13A5基因敲除、沉默或干擾等動物模型中的實驗結(jié)果相一致——肝臟脂質(zhì)合成明顯減弱，脂質(zhì)堆積顯著緩解［3-4］。

1 SLC13A家族

SLC13A家族包括5個基因，即SLC13A1～SLC13A5，其編碼具有8～13個跨膜螺旋的轉(zhuǎn)運蛋白。這些共轉(zhuǎn)運蛋白位于上皮細胞的質(zhì)膜上，表達廣泛，但主要分布于肝、腎、小腸、胎盤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它們在不同的器官中發(fā)揮著不同的生理、病理作用。按照功能，SLC13A家族成員可分為兩類：（1）轉(zhuǎn)運硫酸鹽、硒和硫代硫酸鈉的共轉(zhuǎn)運蛋白（sodium-sulfate cotransporter，NaS），包 括SLC13A1 和 SLC13A4；（2）轉(zhuǎn) 運 三 羧 酸 循 環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）中間體琥珀酸、檸檬酸和α-酮戊二酸等的共轉(zhuǎn)運蛋白（sodium-di and tri-carboxylate cotransporter，NaDC），包括 SLC13A 2、SLC13A3和SLC13A5［5］。

SLC13A1，也被稱為NaS或NaSi-1，主要定位于腎近端小管和腸上皮細胞的頂端刷狀緣膜，對維持硫酸鹽穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。SLC13A1基因缺陷小鼠表現(xiàn)出許多病理特征，如低硫血癥、高硫尿、體質(zhì)量下降、出生后生長和生育力下降、循環(huán)類固醇水平降低、糖皮質(zhì)激素增加以及肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝改變等［6-7］。SLC13A4主要在胎盤和睪丸中表達，在腦、心臟、胸腺、肝臟和扁桃體中則表達較少，主要維持硫酸鹽的穩(wěn)態(tài)。硫酸鹽是胎兒生長發(fā)育的必需營養(yǎng)素［8］。有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中，腎臟SLC13A1在孕鼠中維持著較高的硫酸鹽循環(huán)水平，而胎盤中SLC13A4可調(diào)節(jié)胎鼠的硫酸鹽供應(yīng)。這兩個基因都與小鼠嚴重的胚胎缺陷和胎鼠流產(chǎn)有關(guān)。但是，SLC13A1和SLC13A4在人類妊娠中的臨床意義尚不清楚［9］。

SLC13A2/NaDC1、SLC13A3/NaDC3 以 及SLC13A5則負責將細胞內(nèi)的陰離子中間體如檸檬酸和琥珀酸從血液輸送到細胞內(nèi)，這些中間體可以作為能源或細胞內(nèi)的信號分子，參與到細胞的能量代謝和糖脂代謝中。其中，SLC13A2和SLC13A3主要在腎臟和腸道表達，兩者對琥珀酸的親和力高于檸檬酸，通過阻斷SLC13A2和SLC13A3可以抑制腎臟對檸檬酸的再攝取，增加檸檬酸的腎排泄，并且可以防止鈣沉積形成腎結(jié)石［10］。與前兩者不同，SLC13A5主要在肝臟表達，對檸檬酸的親和力最高，其主要功能是將血液循環(huán)中的檸檬酸轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，參與脂質(zhì)從頭合成途徑生成脂肪酸，調(diào)控細胞內(nèi)糖脂代謝［11］（表1）。

2 檸檬酸在糖脂代謝中的作用

在正常的生理條件下，組織中的檸檬酸來源于血漿，其檸檬酸濃度相對恒定，范圍為50～200 μmol/L［16-17］。肝臟是脂質(zhì)合成與代謝的主要場所，肝臟內(nèi)檸檬酸來源主要有3個途徑：（1）由TCA并經(jīng)由線粒體檸檬酸轉(zhuǎn)運體（SLC25A1/mitochondrial citrate carrier，CIC）轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)；（2）由質(zhì)膜上的檸檬酸轉(zhuǎn)運體（SLC13A5/PMCT）將血液循環(huán)中的檸檬酸轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)；（3）由谷氨酰胺分解產(chǎn)生的α-酮戊二酸經(jīng)過羧化反應(yīng)產(chǎn)生檸檬酸。不論哪種來源的檸檬酸，均需要在胞質(zhì)中的ATP依賴性檸檬酸裂解酶（ATP-dependent citrate lyase，ACLY）作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）和乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），其中，乙酰輔酶A是生物合成三酰甘油（triglyceride，TG）、脂肪酸、低密度脂蛋白和膽固醇的重要前體分子。此外，檸檬酸還可以通過促進聚合，激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coA carboxylase，ACC），后者則是催化脂質(zhì)從頭合成的關(guān)鍵限速步驟［18］。另外，檸檬酸可以抑制多種糖酵解的關(guān)鍵酶，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)抑制磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK），同時通過降低1，6-二磷酸果糖的水平間接抑制丙酮酸激酶，從而對糖酵解產(chǎn)生負反饋作用［19］，同時通過激活1，6-二磷酸果糖激酶（fructose 1，6-bisphosphate phosphatase，F(xiàn)-1，6-BP）刺激糖異生，最終協(xié)調(diào)糖脂代謝［20-21］。因為檸檬酸能激活脂肪酸合成，影響糖異生和糖酵解通量，所以胞漿檸檬酸濃度與脂肪生成直接相關(guān)，是肝臟脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑（圖1）。

表1 SLC13A家族成員在不同種屬中的分布及生理功能[12-15]

3 SLC13A5的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控

圖1 調(diào)控檸檬酸在肝臟生物代謝中的作用[22]PMCT:質(zhì)膜上的檸檬酸轉(zhuǎn)運體;F-1,6-BP:1,6-二磷酸果糖激酶;ACLY:ATP依賴性檸檬酸裂解酶;OAA:草酰乙酸;ACC:乙酰輔酶A羧化酶;PFK:磷酸果糖激酶;CIC:線粒體檸檬酸轉(zhuǎn)運體;TG:三酰甘油

SLC13A5作為調(diào)控細胞內(nèi)糖脂代謝的重要靶點，其轉(zhuǎn)錄與調(diào)控受到越來越多的關(guān)注，許多研究成果為SLC13A5作為代謝性疾病潛在治療靶點的深入研究提供了理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，SLC13A5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是由營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)的，這表明代謝因素參與了該過程。例如，在果蠅中限制熱量攝入，可以顯著降低SLC13A5的表達［23］。小鼠饑餓超過36 h后，其肝臟內(nèi)SLC13A5的表達會明顯減少［3］。相反，大鼠灌胃給予大量橄欖油，會誘導(dǎo)其肝臟中SLC13A5表達顯著升高［24］。Etcheverry等［25］通過全基因組甲基化與基因表達的綜合分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤患者中隨著其啟動子的高甲基化，肝臟SLC13A5的表達會明顯下調(diào)，證明SLC13A5的調(diào)節(jié)主要由表觀遺傳機制介導(dǎo)。

Neusch?fer-Rube等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝原代細胞中，饑餓早期釋放的胰高血糖素可以調(diào)節(jié)SLC13A5的表達水平。胰高血糖素通過與SLC13A5啟動子區(qū)域cAMP依賴性反應(yīng)元件蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）的結(jié)合位點結(jié)合，瞬時增加SLC13A5的表達。體內(nèi)研究表明，高脂飲食-鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟中SLC13A5水平升高，其中CREB是結(jié)構(gòu)性活躍的。該課題組后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，SLC13A5為芳基碳氫化合物受體（arylhyrocarbon receptor，AhR）的靶基因，誘導(dǎo)AhR依賴的SLC13A5基因表達增加可能與肝臟脂肪變性有關(guān)［27］。高能量飲食和苯并［a］芘能夠激活A(yù)hR并異源二聚化為AhR核轉(zhuǎn)運子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，Arnt），通過與SLC13A5啟動子中潛在的結(jié)合位點結(jié)合，使其移位到細胞核并激活和上調(diào)SLC13A5轉(zhuǎn)錄。該課題組已經(jīng)在大鼠和人SLC13A5的啟動子區(qū)域中確定了AhR可能的結(jié)合位點。試驗證實AhR激動劑苯并［a］芘以AhR依賴的方式誘導(dǎo)大鼠肝原代細胞SLC13A5表達升高，使檸檬酸攝取和脂質(zhì)合成增加，進而造成肝臟脂肪沉積。

愈來愈多的研究將SLC13A5的轉(zhuǎn)錄與脂質(zhì)代謝聯(lián)系起來。SLC13A5已被確定為孕烷X受體（pregnant X receptor，PXR）的一個新的轉(zhuǎn)錄靶點，而PXR與脂質(zhì)代謝和能量平衡有關(guān)。應(yīng)用基于細胞的熒光素酶報告、電泳遷移率改變和染色質(zhì)免疫沉淀等多種分析手段，鑒定了位于SLC13A5基因轉(zhuǎn)錄起始點上游的兩個增強子模塊，并對它們進行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)它們與PXR介導(dǎo)的SLC13A5誘導(dǎo)有關(guān)。給予PXR激動劑利福平，人肝原代細胞中SLC13A5 mRNA和蛋白水平以及脂質(zhì)含量均顯著升高；而單獨下調(diào)SLC13A5表達可導(dǎo)致HepG2細胞脂質(zhì)含量顯著降低。上述研究表明，SLC13A5水平升高在肝臟脂肪變性和代謝紊亂中具有重要作用［28］。

另外，von Loeffelholz等［2］研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)輸注白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）14 d后，小鼠肝臟SLC13A5 mRNA水平顯著提高，肝臟中檸檬酸的攝取和脂肪酸的合成均增加。其機制可能與白細胞介素受體磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子STAT3激活以及后者轉(zhuǎn)移到細胞核有關(guān)。研究結(jié)果最終揭示IL-6/STAT3通路在體內(nèi)的激活增加了SLC13A5的表達，從而增加檸檬酸的攝取和肝臟的脂肪生成。

4 SLC13A5在代謝性疾病中的作用

von Loeffelholz等［2］首次報道了NAFLD患者肝臟中SLC13A5水平升高與脂肪變性之間的直接聯(lián)系。其研究發(fā)現(xiàn)在偏瘦的個體中，SLC13A5表達降低與低水平的肝臟脂肪有關(guān)，而在體重指數(shù)增加和肝臟脂肪含量高的個體中，SLC13A5水平則升高。同樣，在非靈長類動物中，給予高脂肪高蔗糖飲食以及高脂肪低蛋氨酸、膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的小鼠，其肝臟中SLC13A5水平顯著升高。另外，該團隊還對NAFLD患者和對照樣本進行了肝臟微陣列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肝臟全基因組轉(zhuǎn)錄水平的變化與參與脂質(zhì)合成、代謝和免疫過程的基因表達增加之間存在關(guān)聯(lián)。

考慮到SLC13A5與脂質(zhì)代謝之間的聯(lián)系，將SLC13A5作為治療代謝紊亂的重要靶點已成為研究熱點。越來越多的研究已證實，敲除SLC13A5基因和藥理性抑制SLC13A5均可以改善NAFLD、肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病。

4.1 SLC13A5與肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)系研究

Birkenfeld 等［3］研究證實，整體敲除 SLC13A5基因的小鼠可以避免HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗、NAFLD和肥胖等代謝性疾病的發(fā)生。而這種保護作用主要是通過減少肝臟新生脂肪生成、增加肝臟脂質(zhì)氧化、改善線粒體脂質(zhì)氧化等過程實現(xiàn)。

Brachs等［29］的研究也發(fā)現(xiàn)，通過siRNA選擇性地敲除/沉默小鼠肝臟內(nèi)SLC13A5基因，可以顯著改善高胰島素-正常血糖鉗夾試驗中的胰島素敏感性，并降低三酰甘油在肝臟中的蓄積，同時不依賴于體重的變化。

應(yīng)用2′-O-甲氧乙基嵌合反義寡核苷酸（2′-O-methoxyethyl chimeric anti-sense oligonucleotide，ASO），選擇性敲除肝臟SLC13A5基因，觀察對高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠全身脂質(zhì)和糖代謝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ASO處理4周后，與對照組相比，ASO處理組體重無明顯變化，肝臟SLC13A5 mRNA表達降低91%，空腹血漿胰島素水平降低74%，血漿三酰甘油降低35%，肝臟三酰甘油含量亦顯著降低。在高胰島素-正常血糖鉗試驗中，肝臟糖異生降低25%［30］。這些數(shù)據(jù)表明敲除SLC13A5基因可以改善肝臟葡萄糖生成、增強胰島素敏感性和保護NAFLD等代謝性疾病的代謝表型。

另外，Li等［31］應(yīng)用shRNA沉默人肝癌細胞系HepG2和Huh7中SLC13A5基因的表達，可顯著抑制細胞增殖、集落形成和誘導(dǎo)細胞周期停滯。其機制可能是通過影響細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過程實現(xiàn)的：敲除SLC13A5基因后，HepG2和Huh7細胞內(nèi)檸檬酸濃度、ATP/ADP比率、磷脂含量和ATP依賴性檸檬酸裂解酶表達降低。而這些發(fā)現(xiàn)也進一步證實了上述提到的SLC13A5基因敲除小鼠試驗中的研究結(jié)果［3］。

4.2 SLC13A5抑制劑的研究

Sun等［32］最先使用質(zhì)膜轉(zhuǎn)運體的同源模型和基于蛋白脂質(zhì)體的試驗，通過分子對接技術(shù)初步篩選SLC13A5的小分子抑制劑，并檢測它們對檸檬酸轉(zhuǎn)運的抑制活性，其中有的小分子抑制劑的抑制率可達到約73%。但這些抑制劑在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄均較差，因而限制其進一步的研究與開發(fā)。

輝瑞公司研發(fā)的一種新型二羧酸鹽小分子化合物PF-06649298，在體內(nèi)外均能有效地抑制SLC13A5對檸檬酸的轉(zhuǎn)運，并且具有較高的選擇性［4］。轉(zhuǎn)運試驗結(jié)果表明，PF-06649298是以底物競爭和立體變構(gòu)的方式與SLC13A5特異性結(jié)合，即作為SLC13A5轉(zhuǎn)運的底物產(chǎn)生抑制作用，這恰好與基于底物的設(shè)計策略相吻合。小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周后，按照250 mg/kg的劑量給予PF-06649298或賦形劑，每天2次，連續(xù)3周。結(jié)果顯示，在口服葡萄糖耐量試驗中，PF-06649298組可以完全逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的葡萄糖耐量的降低。此外，與高脂飲食模型組相比，PF-06649298組的小鼠肝臟和血漿三酰甘油含量顯著降低，而酰肉堿、β-羥基丁酸酯濃度則明顯增加。隨后，有研究人員應(yīng)用分子建模技術(shù)、SLC13A5基因定點突變、轉(zhuǎn)運特性和細胞表面生物素化等多種手段來確定參與抑制劑結(jié)合和轉(zhuǎn)運的殘基［33］。然而，由于PF-06649298在體內(nèi)的暴露和效力有限，不能對其機制進行廣泛的活體表征。但是其研究結(jié)果為SLC13A5抑制劑的轉(zhuǎn)運和抑制機制研究提供了新的見解，并為未來SLC13A5抑制劑的藥物設(shè)計與開發(fā)提供了依據(jù)。

借鑒PF-06649298的設(shè)計和開發(fā)經(jīng)驗，Huard等［34］又發(fā)現(xiàn)了一種更有效的抑制劑PF-06761281，在抑制人肝細胞攝取檸檬酸方面的效力是前者的20倍，同時對SLC13A5的體外選擇性是前者的25倍。用放射性［14C］-檸檬酸進行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在嚙齒類動物的肝臟中，PF-06761281對［14C］-檸檬酸攝取的抑制呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，即抑制效力高度依賴于環(huán)境中檸檬酸的濃度［35］。結(jié)合基因敲除模型、基因沉默或干擾等試驗得到的結(jié)果，表明PF-06761281可明顯減弱肝臟脂質(zhì)合成，顯著緩解脂質(zhì)堆積。但PF-06761281在體內(nèi)會增加血漿和尿液中檸檬酸鹽的濃度，因此其應(yīng)用和安全性還有待進一步的研究。

5 總結(jié)與展望

NAFLD、肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾病，影響因素多，發(fā)病機制復(fù)雜，臨床無特效藥物，已成為日益嚴重的全球性問題，逐年升高的發(fā)病率為全球醫(yī)療帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔，影響人民的健康生活。

越來越多的體內(nèi)外研究已經(jīng)證實，上述代謝性疾病患者肝臟中SLC13A5的表達顯著增加。SLC13A5表達缺失或降低可以減少肝臟檸檬酸的攝取與轉(zhuǎn)運，進而降低脂質(zhì)從頭合成的通量，抑制肝臟脂肪沉積，改善肝臟胰島素和葡萄糖水平，對糖脂代謝的調(diào)節(jié)具有積極的意義?；赟LC13A5與代謝性疾病發(fā)生發(fā)展過程的高度相關(guān)性，可以推測，SLC13A5將成為未來代謝性疾病研究極具潛力的作用靶點，對其分子藥理學(xué)機制的深入研究則可以為藥物開發(fā)和臨床診療提供新的思路和策略。