植物生長調(diào)節(jié)劑對金線蓮玻璃化苗復壯與增殖的影響

劉芳，唐映紅，李春艷，鞏媛，毛凱權(quán)，陳建榮*

(1.長沙學院 生物與環(huán)境工程學院，湖南 長沙 410022；2.湖南文理學院 生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，別名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金錢仔草等.金線蓮全草均可入藥，其功效范圍廣泛，主治咯血、腎炎、膀胱炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疑難病癥[1-3].金線蓮只能生長在人跡罕至處于原始生態(tài)的深山老林內(nèi)，對壞境要求極為嚴格.金線蓮自然繁殖率低，自然繁殖大量的金線蓮非常困難[4].由于生態(tài)環(huán)境惡化和對金線蓮需求的增加，導致野生金線蓮資源瀕臨滅絕[5].常規(guī)扦插或嫁接繁殖速度慢、繁殖系數(shù)低、成本高，因此難以大規(guī)模應用[6].隨著科學技術(shù)的發(fā)展，目前通過植物組織培養(yǎng)方法探索建立金線蓮高效穩(wěn)定的誘導愈傷組織培養(yǎng)系統(tǒng)和進行再生試管苗的培養(yǎng)，可以解決金線蓮在國內(nèi)推廣應用的問題，也可以起到保護野生的金線蓮資源的作用[7].近年來金線蓮的組培技術(shù)得到了迅速地發(fā)展，但是在誘導愈傷組織的過程中常常會發(fā)生試管苗玻璃化的現(xiàn)象，造成試驗材料的浪費和試驗進度的緩慢.

玻璃化是一種生理失調(diào)或者生理病變，是指在植物離體培養(yǎng)的過程中，植物幼苗呈半透明水漬狀，玻璃化的植株難以移栽成活[8-10].可通過適當提高光照強度、注意通氣、適當降低培養(yǎng)基中銨根離子濃度、細胞分裂素與生長激素配比和鉀離子之間的配合使用、控制溫度等方法降低或改善組培苗玻璃化[11-12].本試驗通過調(diào)節(jié)生長素和細胞分裂素的配比對金線蓮玻璃化組培苗的復壯、以及復壯苗的增殖生長能力進行研究，為金線蓮的快速繁殖提供參考.

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為已經(jīng)玻璃化的金線蓮組培叢生芽.

1.2 試驗方法

1.2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對玻璃化苗復壯、增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同配比的6-BA和NAA，共設(shè)置49種培養(yǎng)基(見表1)，首先對玻璃化苗進行復壯培養(yǎng)，然后將復壯苗移植至新的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng).其中，培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L、瓊脂9 g/L、pH值5.8.

表1 不同生長調(diào)節(jié)劑配比

1.2.2 培養(yǎng)條件

上述試驗每個處理設(shè)10次重復，每瓶接種3～5個外植體.于溫度25 ℃、光照強度1 500 lx、光照時間12 h/d條件下連續(xù)培養(yǎng)觀察芽的復壯、增殖及生長情況.

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

復壯和增殖培養(yǎng)30 d后進行統(tǒng)計分析.復壯率=復壯芽數(shù)*100/接種的外植體株數(shù)，記錄10次重復的平均數(shù)作為最終結(jié)果，以玻璃化苗的葉片變成翠綠色為復壯依據(jù)；增殖率=增殖后的總株數(shù)/接種的外植體株數(shù)，記錄10次重復的平均數(shù)作為最終結(jié)果，并于試驗結(jié)束時，目測芽生長情況并用5級表示，分別記為：“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”表示，試驗數(shù)據(jù)用DPS軟件進行多重比較分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對玻璃化苗復壯的影響

由表2可以看出，49個處理都有不同程度的玻璃化苗復壯，其中以組合F1S1、F2S1、F5S1、F6S1、F7S1及F5S5復壯率較高，均達到了80.0%以上，其中以組合F5S5即2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA復壯效果最好，其復壯率可達到88.9%，培養(yǎng)30 d后，產(chǎn)生大量原球莖(圖1-f)，由表3可知，6-BA、NAA兩種因素對玻璃化苗復壯均有顯著的相關(guān)性，說明6-BA、NAA這2種生長調(diào)節(jié)劑對玻璃化苗都有明顯的效果，其中以6-BA效果較好(F=13.794 3)，NAA(F=0.657 9)較差.由表4可知，各因素不同濃度之間的差異也有所不同，不同6-BA濃度之間具有顯著性，不同NAA濃度之間無顯著性.因此，根據(jù)正交試驗優(yōu)先選擇原則，結(jié)合復壯率的直觀分析，兩種因素配比時的復壯效果較好，可得出2種因素的最佳配比為F5S5，即MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/ L NAA.

表2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比下玻璃化苗復壯情況(30 d后)Table 2 Recovery of vitrified seedlingsin the proportion of different growth regulators(after 30 days)

表3 玻璃化苗復壯情況方差分析

表4 各因素不同濃度之間玻璃化苗復壯情況方差分析Table 4 Analysis of variance on recovery of vitrified seedlings between different concentrations of various factors

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對復壯苗增殖生長的影響

由表5的結(jié)果可知，金線蓮在復壯的基礎(chǔ)上都有不同程度的增殖，組合Z1H1、Z1H2、Z1H3、Z1H4、Z1H5、Z1H6、Z1H7增殖效果較好，其中以組合Z1H5的增殖效果最好，增殖率達到了59.8%，其在復壯時產(chǎn)生原球莖，30 d后原球莖上形成大量叢生芽，生長旺盛，長勢喜人(圖1-g).

表5 復壯苗增殖情況

表6的方差分析結(jié)果中F值顯示，Z因素和H因素對復壯苗的增殖均有顯著的相關(guān)性，說明6-BA和NAA這2種生長調(diào)節(jié)劑配比對復壯苗增殖都有非常明顯的效果，其中以6-BA效果較好(F=54.244 4)，NAA較差(F=1.012 5).由表7可知，NAA各濃度之間的差異較小，但6-BA各濃度之間差異較大，通過比較得出：2.0 mg/L 6-BA和0.01 mg/L NAA組合，即Z1H5時的效果最好.因此，適合復壯苗增殖的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA.

表6 復壯苗增殖情況方差分析Table 6 Analysis of variance on proliferation of resuscitated seedlings

表7 各因素不同濃度之間復壯苗增殖情況方差分析Table 7 Analysis of variance on proliferation of resuscitated seedlings between different concentrations of various factors

圖1 金線蓮玻璃化苗恢復情況Fig.1 Restoration of vitrified seedling of Anoectochilus auriculata

3 討論

植物玻璃化是植物組織培養(yǎng)中常見的現(xiàn)象，易導致試驗材料的浪費及試驗進度的緩慢.已有文獻指出，玻璃化苗隨著培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境的改變其變化是可逆的[8，13-15].目前已知的玻璃化苗復壯的方法包括增強通風[7]、適度的低溫處理[16]、改變pH[17]、激素配比[18]和加入活性炭[19]等.本試驗從激素配比方面進行研究，探討不同的生長素和細胞分類素配比對玻璃化苗復壯的影響，結(jié)果顯示，不同的激素配比對玻璃化苗復壯有著顯著的影響，其中MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的組合效果最佳，玻璃化苗復壯率達88.9%，玻璃化苗對6-BA更加敏感，復壯率隨6-BA濃度的變化，波動較大，高濃度的NAA、6-BA均不利于玻璃化苗的復壯.

本試驗在玻璃化苗復壯的基礎(chǔ)上取到了較好的再增殖效果.不同的激素配比組合中金線蓮原球莖增殖40倍～50倍，其中MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA試驗組增殖率達到59.8%.6-BA對金線蓮的增殖影響較大，NAA的影響較弱，金線蓮增殖率隨6-BA濃度變化波動較大，王雅英等[14]通過正交試驗也認為6-BA、NAA、KT三種激素對金線蓮增殖系數(shù)影響大小為6-BA>NAA>KT.當然也有其他的研究者提出不同的增殖或誘導的配方，如王健勤等[20]提出的改良MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/LKT原球莖誘導配方，陳兆貴[21]提出的MS +2.0 mg/L ～3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L～0.5 mg/L NAA增殖配方.

4 結(jié)論

MS +2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA是最佳的金線蓮玻璃化苗的復壯培養(yǎng)基，玻璃化苗復壯率達88.9%.復壯后的玻璃化苗最佳增值培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，接種在該培養(yǎng)基中的金線蓮苗產(chǎn)生原球莖，增殖率達到59.8%.本試驗在玻璃化苗復壯的基礎(chǔ)上獲得了較高的增殖率，增殖效果好，對金線蓮的快速繁殖具有重要參考價值.