• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    飛燕草素抑制大鼠乳腺癌發(fā)生的機(jī)制探索*

    2020-10-28 08:41:08白金玉宋慧敏徐苗徐嘉琪韓彬彭曉莉
    腫瘤預(yù)防與治療 2020年10期
    關(guān)鍵詞:素能劃痕受體

    白金玉,宋慧敏,徐苗,徐嘉琪,韓彬,彭曉莉

    610500 成都,成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院

    近二十年來(lái),全球乳腺癌的發(fā)病率不斷上升,成為很多地區(qū)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,威脅女性的身心健康[1]。植物化學(xué)物抗癌研究成為乳腺癌防治研究的方向之一[2]?;ㄇ嗨貙冱S酮類化合物,在植物中花青素以花色苷的形式存在,具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性,對(duì)多種疾病具有防治作用,如腫瘤、心血管疾病等[3]。飛燕草素是花青素中常見(jiàn)的一種單體,生物學(xué)活性較強(qiáng),研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,具有抗乳腺癌的作用[4-6]。乳腺癌是激素依賴性腫瘤,雌激素受體表達(dá)是乳腺癌內(nèi)分泌治療的一項(xiàng)重要指標(biāo)。雌激素通過(guò)與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)。雌激素受體包括核受體和膜受體。雌激素受體-α(estrogen receptor-α,ER-α)屬核受體,位于細(xì)胞核中,與其配體結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。乳腺癌內(nèi)分泌治療的雌激素替代療法就是以ER-α作為治療指標(biāo)[7]。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein coupled estrogen receptor,GPER)屬膜受體,與配體結(jié)合后能快速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),在乳腺癌的發(fā)生中也發(fā)揮著重要作用[8]。

    本課題組前期通過(guò)建立甲基亞硝基脲(1-methyl-1-nitrosourea,MNU)誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生模型,發(fā)現(xiàn)飛燕草素能顯著抑制大鼠乳腺癌發(fā)生[9]。為進(jìn)一步探討飛燕草素抑制乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)取飛燕草素膳食干預(yù)致癌物誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的大鼠模型乳腺組織,檢測(cè)大鼠乳腺組織中ER-α的表達(dá)水平,并通過(guò)乳腺癌MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探索飛燕草素是否通過(guò)調(diào)節(jié)ER-α和GPER的表達(dá)而抑制乳腺癌的發(fā)生。另外,ER-α對(duì)Notch信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用[10],而Notch信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用,并且通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲,是促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[11]。因此,本研究亦嘗試探討飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響,為飛燕草素抗乳腺癌的機(jī)制探索提供研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    飛燕草素(純度25%)購(gòu)于中國(guó)大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司。ER-α和GPER抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。MNU和雌二醇購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

    1.2 儀器

    主要使用儀器包括日本Olympus公司的IX71型倒置熒光相差顯微鏡;美國(guó)Thermo公司的Biofuge stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和ND-2000微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì);Bio-Rad伯樂(lè)公司PCR儀,石蠟切片儀。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    清潔級(jí) Sprague-Dawley(SD)大鼠:40~50 d,體重140~160 g,大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,常規(guī)飲食,環(huán)境濕度保持40%~50%,環(huán)境溫度保持(22±2)℃。

    1.4 飛燕草素干預(yù)大鼠乳腺癌發(fā)生模型的建立

    動(dòng)物分組及處理方式:雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組12只;對(duì)照組16只;飛燕草素干預(yù)組16只。大鼠分組后,適應(yīng)飼養(yǎng)7 d,對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組給予MNU注射,正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水注射。MNU臨用前,使用含0.05%冰醋酸的無(wú)菌生理鹽水配制成10 mg/mL的溶液,以50 mg/kg體重的劑量,對(duì)大鼠進(jìn)行單次腹腔注射。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,飛燕草素干預(yù)組以灌胃方式給予飛燕草素,灌胃劑量為100mg/kg/d,;對(duì)照組和正常對(duì)照組組給予等體積生理鹽水灌胃。大鼠每周稱重1次,自由飲食和飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠乳腺組織石蠟切片。

    1.5 免疫組化染色

    乳腺組織石蠟包埋,切片后進(jìn)行免疫組化染色,辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理,用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照,雌激素受體抗體免疫組化染色后以細(xì)胞核呈中等強(qiáng)度棕黃色判定為陽(yáng)性細(xì)胞,在低倍鏡下(×10)瀏覽整張切片選擇熱點(diǎn)區(qū)域,用高倍(×40)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果表示為陽(yáng)性細(xì)胞在整張切片中同類型細(xì)胞中的百分比。

    1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

    人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,常規(guī)方法進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前4 d將細(xì)胞用PBS洗滌后,改用無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    MCF-7細(xì)胞細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),以5×104個(gè)/mL細(xì)胞的密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右,以0、10、20、40 μM飛燕草素作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,120 000×g離心,取上清液,測(cè)定蛋白含量后用于分析。探討雌二醇存在時(shí),飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響,加入1×10-8mol/L雌二醇12 h以后,再加入40 μM飛燕草素作用MCF-7細(xì)胞24 h后提取蛋白。

    1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

    對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞以1×105/mL密度接種于12孔培養(yǎng)板。細(xì)胞生長(zhǎng)至75%密度,分別以0、20、40 μM飛燕草素作用細(xì)胞,24 h后用20 μL槍頭沿線垂直劃痕,PBS沖洗除去懸浮細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,在劃痕0、24 h和48 h拍照,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取5個(gè)視野。計(jì)算遷移率,計(jì)算公式為:遷移率(%)=劃痕后某時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的無(wú)細(xì)胞區(qū)域面積/劃痕后測(cè)得的劃痕面積×100%。

    1.8 Western blot檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α、GPER、Notch-1和 PTEN蛋白表達(dá)

    調(diào)節(jié)蛋白樣品濃度,保證每個(gè)樣品上樣量為35 μg。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜,BSA封閉非特異結(jié)合位點(diǎn),ER-α和GPER抗體4℃孵育過(guò)夜;二抗孵育后,化學(xué)試劑顯色發(fā)光,采用多功能成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

    1.9 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)ER-α和GPER mRNA水平

    飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR方法檢測(cè)ER-α和GPER mRNA水平。采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度后,加入4 μg cDNA、12.5 μL SYBR混合物和1 μL引物組成25μL反應(yīng)體系。首先在95℃下變性10 min,并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95℃15 s,60℃ 1 min)。按體系進(jìn)行反應(yīng),各基因分別設(shè)3孔平行。采用結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),將GAPDH作為內(nèi)參照的基因。所用的引物見(jiàn)表1。

    表1 qPCR引物序列

    1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

    2 結(jié) 果

    2.1 飛燕草素對(duì)乳腺癌組織雌激素受體表達(dá)的影響

    實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組、對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組大鼠乳腺組織ER-α均有陽(yáng)性表達(dá)。與正常對(duì)照組比較,MNU致癌組大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)顯著增高(P<0.01),飛燕草素干預(yù)大鼠能明顯降低大鼠乳腺組織ER-α的表達(dá)(P<0.01)。

    圖1 飛燕草素對(duì)致癌物誘導(dǎo)大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)的影響 (×400)

    2.2 飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響

    劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示,24 h時(shí),40 μM飛燕草素作用后細(xì)胞劃痕面積明顯高于0 μM和20μM飛燕草素作用后的細(xì)胞(P<0.01,P<0.05);48 h時(shí),40 μM飛燕草素作用后細(xì)胞劃痕面積明顯高于0 μM和20 μM飛燕草素作用后的細(xì)胞(P<0.01)。結(jié)果表明40 μM飛燕草素作用細(xì)胞后,能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力(圖2),提示飛燕草素對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用。

    圖2 飛燕草素對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響

    2.3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

    根據(jù)CCK-8預(yù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)采用0、10、20、40 μM飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞,通過(guò)Western blot檢測(cè)飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響。由圖3可見(jiàn),飛燕草素能明顯降低MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果也顯示,飛燕草素能顯著降低MCF-7細(xì)胞中ER-α和GPER mRNA水平(P<0.01)(圖4,圖5)。

    圖3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

    2.4 雌二醇存在條件下飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

    為了進(jìn)一步探討飛燕草素對(duì)ER-α和EPER蛋白表達(dá)是否與雌激素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)在飛燕草素作用MCF-7細(xì)胞以前,在培養(yǎng)液中加入1×10-8mol/L雌二醇,再檢測(cè)ER-α和EPER蛋白表達(dá)。由圖6可見(jiàn),雌二醇作用后的MCF-7細(xì)胞,40 μM飛燕草素仍能降低ER-α和EPER蛋白表達(dá)水平,提示飛燕草素在雌二醇環(huán)境下仍能抑制ER-α和EPER蛋白表達(dá)。

    圖4 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α mRNA水平的影響

    圖5 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞GPER mRNA水平的影響

    圖6 雌二醇環(huán)境下飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和EPER蛋白表達(dá)的影響

    2.5 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch-1/PTEN信號(hào)通路的影響

    飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞24 h后檢測(cè)飛燕草素對(duì)Notch通路的Notch-1和PTEN蛋白表達(dá)的影響。由WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖7)可見(jiàn),20 μM和40 μM飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞能顯著降低細(xì)胞Notch-1蛋白表達(dá),提高PTEN蛋白表達(dá)水平。

    3 討 論

    雌激素在體內(nèi)與雌激素受體結(jié)合,發(fā)生雌激素受體二聚化后,與靶基因的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合,繼而激活Notch、MAPK、PI3K和JNK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生[12]。人工合成的純雌激素拮抗劑氟維司群就是利用其可與ER-α結(jié)合的能力,阻斷雌激素受體的信號(hào)途徑,而成為抗乳腺癌的藥物[13]。GPER是一種新型雌激素受體,能夠在多種乳腺癌細(xì)胞中介導(dǎo)雌激素效應(yīng),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖,研究GPER與乳腺癌內(nèi)分泌治療有關(guān)[14]。有研究報(bào)道海南蒲桃(SyzygiumcuminiL,即印度稱為jamun的漿果)富含花色苷,能抑制雌激素誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生,并能降低ER-α蛋白表達(dá)水平[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能顯著抑制致癌物誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生[9]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制大鼠乳腺組織內(nèi)ER-α水平的升高,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)飛燕草素能明顯降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER的蛋白表達(dá)水平,提示飛燕草素作用于雌激素受體通路可能是其發(fā)揮抑制乳腺癌作用的機(jī)制之一。

    研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而雌激素可通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌血管的生成,促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng),阻斷Notch信號(hào)通路的表達(dá)或可成為腫瘤治療的新方向[16]。研究證實(shí)抑制乳腺癌細(xì)胞中的Notch-1通路,能降低其下游蛋白的表達(dá),從而有效地抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。抑癌基因PTEN可通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、抑制腫瘤血管生成等途徑,阻遏抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)激活Notch信號(hào)通路引起PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)是乳腺癌干細(xì)胞發(fā)生耐藥的重要分子機(jī)制,抑制Notch-1,促進(jìn)PTEN的表達(dá),可以提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)藥物敏感性[19]。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飛燕草素能明顯降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá),提高PTEN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示飛燕草素可能通過(guò)雌激素受體,調(diào)節(jié)Notch-1/PTEN信號(hào)通路,從而發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。

    綜上所述,本研究初步發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制致癌物誘導(dǎo)大鼠乳腺癌組織ER-α的表達(dá)增高,對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER的蛋白表達(dá)具有抑制作用,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)飛燕草素能調(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch-1/PTEN信號(hào)通路。飛燕草素是否通過(guò)ER-α調(diào)節(jié)Notch-1/PTEN信號(hào)通路,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    作者聲明:本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任;并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存,可接受核查。

    學(xué)術(shù)不端:本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

    同行評(píng)議:經(jīng)同行專家雙盲外審,達(dá)到刊發(fā)要求。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    文章版權(quán):本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。

    猜你喜歡
    素能劃痕受體
    富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
    冰上芭蕾等
    以“學(xué)練賽”為抓手,全面提升干部職工綜合素能
    讓數(shù)學(xué)語(yǔ)言的美麗之花在數(shù)學(xué)殿堂中綻放
    Toll樣受體在胎膜早破新生兒宮內(nèi)感染中的臨床意義
    檢察改革背景下檢察官素能建設(shè)芻議
    犀利的眼神
    2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚對(duì)視黃醛受體和雌激素受體的影響
    光滑表面淺劃痕對(duì)光反射特性
    高職報(bào)關(guān)與國(guó)際貨運(yùn)專業(yè)素能結(jié)合人才培養(yǎng)模式的研究
    山東青年(2014年7期)2014-09-01 10:42:16
    а√天堂www在线а√下载| 黄色丝袜av网址大全| 成人欧美大片| 久久国产精品影院| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲国产欧美人成| 久久久久九九精品影院| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av美国av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 特大巨黑吊av在线直播| 特级一级黄色大片| 亚洲自拍偷在线| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中文字幕久久专区| 久久国产精品影院| 免费电影在线观看免费观看| 男人的好看免费观看在线视频| 精品久久久久久成人av| 免费看光身美女| 最好的美女福利视频网| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩有码中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 免费在线观看影片大全网站| 变态另类丝袜制服| 美女cb高潮喷水在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 无遮挡黄片免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品熟女少妇八av免费久了| 看片在线看免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品久久国产高清桃花| 老女人水多毛片| 国产精品1区2区在线观看.| 搡老岳熟女国产| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲人与动物交配视频| 人人妻人人看人人澡| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲国产欧美人成| 99热6这里只有精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美黑人欧美精品刺激| 最近在线观看免费完整版| 成人美女网站在线观看视频| 国产伦人伦偷精品视频| x7x7x7水蜜桃| 国产伦在线观看视频一区| av中文乱码字幕在线| or卡值多少钱| 最新在线观看一区二区三区| 91狼人影院| 午夜福利高清视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人性生交大片免费视频hd| 色综合婷婷激情| 欧美又色又爽又黄视频| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美中文日本在线观看视频| 黄色一级大片看看| 亚洲综合色惰| 好男人在线观看高清免费视频| 国内精品久久久久精免费| 我的老师免费观看完整版| 波多野结衣高清作品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲国产精品成人综合色| 欧美极品一区二区三区四区| 日本成人三级电影网站| 丰满的人妻完整版| 午夜福利免费观看在线| 亚洲内射少妇av| 亚洲欧美日韩东京热| 免费观看精品视频网站| 免费观看精品视频网站| 人人妻人人看人人澡| netflix在线观看网站| 怎么达到女性高潮| 久久久久久九九精品二区国产| 99热只有精品国产| 可以在线观看的亚洲视频| 99精品在免费线老司机午夜| 国产av在哪里看| 制服丝袜大香蕉在线| 特大巨黑吊av在线直播| 全区人妻精品视频| 免费高清视频大片| 免费在线观看成人毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 69av精品久久久久久| 国产精品久久电影中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 女人被狂操c到高潮| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲美女视频黄频| 99在线视频只有这里精品首页| av专区在线播放| 男人舔奶头视频| 欧美一区二区亚洲| 欧美高清性xxxxhd video| 国产老妇女一区| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲,欧美,日韩| 五月伊人婷婷丁香| 午夜免费激情av| 欧美一级a爱片免费观看看| 我的老师免费观看完整版| 免费高清视频大片| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产日本99.免费观看| 内射极品少妇av片p| 久久亚洲精品不卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 脱女人内裤的视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| www.www免费av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜免费成人在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产av一区在线观看免费| 国产午夜福利久久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆av噜噜一区二区三区| 婷婷亚洲欧美| 久久人人爽人人爽人人片va | 色5月婷婷丁香| eeuss影院久久| 欧美黑人巨大hd| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久久久久久黄片| 欧美在线一区亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美色视频一区免费| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲avbb在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| а√天堂www在线а√下载| 国产在视频线在精品| 国产精品一区二区性色av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老司机午夜福利在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 麻豆av噜噜一区二区三区| 成年版毛片免费区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 97超视频在线观看视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 特级一级黄色大片| 97超视频在线观看视频| 国产69精品久久久久777片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av美国av| 久久久国产成人免费| 日本在线视频免费播放| 欧美日韩综合久久久久久 | 成人毛片a级毛片在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美一级a爱片免费观看看| av在线观看视频网站免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人欧美大片| 国产av不卡久久| 桃红色精品国产亚洲av| 淫妇啪啪啪对白视频| av天堂中文字幕网| 国产不卡一卡二| 淫秽高清视频在线观看| 最近在线观看免费完整版| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区二区性色av| 九九热线精品视视频播放| 无人区码免费观看不卡| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久国产精品影院| 婷婷六月久久综合丁香| 黄色视频,在线免费观看| 久久九九热精品免费| 欧美国产日韩亚洲一区| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本黄色视频三级网站网址| 97碰自拍视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 男女之事视频高清在线观看| 1024手机看黄色片| 国产精品伦人一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| av欧美777| а√天堂www在线а√下载| 国产中年淑女户外野战色| 国产在视频线在精品| 白带黄色成豆腐渣| 色噜噜av男人的天堂激情| 51午夜福利影视在线观看| bbb黄色大片| 亚洲在线观看片| 九九在线视频观看精品| 日本 av在线| 天美传媒精品一区二区| 三级毛片av免费| 欧美高清成人免费视频www| 午夜免费成人在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲,欧美,日韩| 亚洲自拍偷在线| 免费高清视频大片| 一级黄片播放器| 午夜福利成人在线免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲自偷自拍三级| 一级作爱视频免费观看| 少妇的逼水好多| 国产视频一区二区在线看| 国产精品av视频在线免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美一区二区亚洲| 欧美国产日韩亚洲一区| 91九色精品人成在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 床上黄色一级片| 免费高清视频大片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 99国产极品粉嫩在线观看| 嫩草影院新地址| 国产在视频线在精品| 国内精品美女久久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 俺也久久电影网| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 中文字幕av成人在线电影| 最近中文字幕高清免费大全6 | 免费看a级黄色片| 亚洲av电影在线进入| 久久久久性生活片| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av美国av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产老妇女一区| 久久久久久久久久黄片| 99精品久久久久人妻精品| netflix在线观看网站| 无遮挡黄片免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一区二区性色av| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美中文日本在线观看视频| 18+在线观看网站| 久久99热这里只有精品18| 在现免费观看毛片| 窝窝影院91人妻| 最好的美女福利视频网| 男女视频在线观看网站免费| 校园春色视频在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品精品国产色婷婷| 99热6这里只有精品| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 美女免费视频网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 久9热在线精品视频| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日本亚洲视频在线播放| 嫩草影院新地址| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一区二区三区激情视频| 久久久久久国产a免费观看| 免费看日本二区| av天堂中文字幕网| 国产高清视频在线观看网站| 免费在线观看亚洲国产| 波野结衣二区三区在线| 美女黄网站色视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久久久午夜电影| 国产精品永久免费网站| 色哟哟哟哟哟哟| 18禁在线播放成人免费| 亚洲人成网站在线播| 欧美区成人在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 一级黄片播放器| 特级一级黄色大片| 国产私拍福利视频在线观看| 在线看三级毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美激情在线99| 亚洲不卡免费看| ponron亚洲| 天堂√8在线中文| 成人无遮挡网站| 人妻久久中文字幕网| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 久9热在线精品视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲人与动物交配视频| 99久久精品一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本a在线网址| 精品人妻一区二区三区麻豆 | www日本黄色视频网| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精华一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 九色国产91popny在线| 亚洲真实伦在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 成人av一区二区三区在线看| 性色av乱码一区二区三区2| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产精品影院久久| 69av精品久久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 男人和女人高潮做爰伦理| 可以在线观看毛片的网站| 国产三级中文精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品亚洲一区二区| 一夜夜www| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产伦人伦偷精品视频| 观看免费一级毛片| 国产精品影院久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 怎么达到女性高潮| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品久久久久久久久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美区成人在线视频| 亚洲无线在线观看| 校园春色视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜福利成人在线免费观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av成人av| 国产淫片久久久久久久久 | 国产熟女xx| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 男人舔奶头视频| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费搜索国产男女视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产探花在线观看一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99国产精品一区二区三区| 少妇的逼好多水| 老司机午夜福利在线观看视频| ponron亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 九九在线视频观看精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成电影免费在线| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 成人国产一区最新在线观看| 免费搜索国产男女视频| 在线播放无遮挡| 国产精品av视频在线免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲午夜理论影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品福利观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产日本99.免费观看| 少妇高潮的动态图| 欧美性猛交黑人性爽| 天美传媒精品一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人影院久久av| 内射极品少妇av片p| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美成人a在线观看| 久久久久久久久中文| 他把我摸到了高潮在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 99久久精品国产亚洲精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| a在线观看视频网站| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品一区av在线观看| 久久6这里有精品| 国产高清三级在线| av天堂在线播放| 一级作爱视频免费观看| 一区二区三区激情视频| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久久久中文| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 深爱激情五月婷婷| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成年版毛片免费区| 亚洲,欧美精品.| 国产美女午夜福利| 色综合婷婷激情| 丁香欧美五月| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲午夜理论影院| 一区福利在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲,欧美精品.| 美女高潮的动态| 国产精品久久久久久久电影| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲成人久久性| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲内射少妇av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av国产免费在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 网址你懂的国产日韩在线| 乱人视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久九九精品二区国产| 窝窝影院91人妻| 国产在线男女| 国产三级在线视频| 久久久久久久午夜电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 小说图片视频综合网站| 亚洲黑人精品在线| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 色吧在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲美女黄片视频| 久久久色成人| 国产黄片美女视频| 一级毛片久久久久久久久女| 成人欧美大片| 色吧在线观看| 国产成人欧美在线观看| 亚洲自拍偷在线| 成人性生交大片免费视频hd| 国产高清视频在线播放一区| 麻豆国产av国片精品| 身体一侧抽搐| 午夜精品在线福利| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费大片18禁| 在线播放无遮挡| a级毛片a级免费在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲自拍偷在线| x7x7x7水蜜桃| 97碰自拍视频| 一级黄片播放器| 神马国产精品三级电影在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 黄色日韩在线| а√天堂www在线а√下载| 中文资源天堂在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品久久久久久久久av| 日日夜夜操网爽| 成年女人永久免费观看视频| 免费人成在线观看视频色| 久久精品影院6| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品一区二区免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 日本五十路高清| 久9热在线精品视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美黑人巨大hd| 亚洲色图av天堂| 欧美在线一区亚洲| 成人国产综合亚洲| 国产高清有码在线观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 搡老妇女老女人老熟妇| 一本综合久久免费| 99在线人妻在线中文字幕| 国产高清三级在线| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲久久久久久中文字幕| www日本黄色视频网| 成年女人毛片免费观看观看9| av在线观看视频网站免费| 午夜激情欧美在线| 日韩人妻高清精品专区| 国产人妻一区二区三区在| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在现免费观看毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩精品中文字幕看吧| 最近中文字幕高清免费大全6 | 在线观看66精品国产| 麻豆成人av在线观看| 一本久久中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产亚洲av嫩草精品影院| 999久久久精品免费观看国产| 日韩有码中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99热这里只有是精品在线观看 | 18美女黄网站色大片免费观看| 国产老妇女一区| 国模一区二区三区四区视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲久久久久久中文字幕| 精品国产三级普通话版| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久中文看片网| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 色综合站精品国产| 在线播放无遮挡| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美日韩东京热| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线观看免费视频日本深夜| 好男人在线观看高清免费视频| 日本黄大片高清| 热99re8久久精品国产| 久久精品人妻少妇| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人av教育| 97碰自拍视频| 很黄的视频免费| 日本五十路高清| 国产v大片淫在线免费观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 九色成人免费人妻av| 俺也久久电影网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩精品中文字幕看吧| 久久6这里有精品| 在线观看66精品国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 直男gayav资源| 欧美精品国产亚洲|