響應面法優(yōu)化Fenton氧化預處理楊木的研究

雷珊珊 石 艷 支亞美 尹 浩 姚 蘭

（湖北工業(yè)大學材料與化學工程學院，湖北武漢，430068）

纖維素乙醇，即第二代生物質乙醇，是指由富含纖維素的植物纖維原料經(jīng)預處理、纖維素酶解及酵母發(fā)酵等過程制備得到的液體燃料。其中，預處理是必不可少的重要步驟，主要作用為破除木質纖維原料的酶解障礙，增加纖維素在酶解過程中的可及度以提高葡萄糖得率［1］。預處理方法包括物理法、化學法和生物法。其中，化學法是最有可能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種預處理方法，主要包括酸預處理、堿預處理和有機溶劑預處理［1］。Fenton反應由于產(chǎn)生具有高氧化強度的羥基自由基（·OH），可以模擬木質纖維素的生物降解［2-4］，具有低能耗、抑制物產(chǎn)生少等優(yōu)點，是目前最有前途的預處理技術之一［5-7］。H2O2是一種氧化性很強的氧化劑，在低濃度下其反應速率很慢，但加入鐵鹽后會顯著增加其氧化性，在酸性條件下可產(chǎn)生羥基自由基（Fe2++H2O2=Fe3++·OH+OH-）［8］。目前，F(xiàn)enton氧化預處理已經(jīng)應用于處理稻草，并獲得了93.2%的酶解糖化產(chǎn)率［9］。Fenton氧化與NaOH萃取結合預處理甘蔗渣，在同步糖化發(fā)酵條件下酶解率為64.7%，乙醇濃度可達17.44 g/L［10］。研究表明，鐵鹽的種類和濃度、pH值及H2O2的加入量都會影響Fenton氧化預處理的效果［5-6］。最近的一項研究在對FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O、Fe2（SO4）3和FeCl3·6H2O進行比較后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3·6H2O是Fenton氧化預處理稻稈最有效的鐵鹽［6］。當使用三價鐵鹽參與Fenton反應時，首先發(fā)生的反應是Fe3++H2O2=Fe2++·OOH+H+，然后生成Fe2+再與H2O2反應生成·OH。且鑒于二價鐵鹽在實際應用中往往不穩(wěn)定；因此，本研究采用三價鐵鹽進行Fenton氧化預處理。

響應面法是優(yōu)化多個交叉因子獲得最大產(chǎn)值的一種數(shù)學模型類優(yōu)化工具［11］，可以從實驗數(shù)據(jù)中解決多元方程的問題，并且可以同時計算和評估這些因子從而得出最佳設計方案［12］，在預處理植物纖維原料制備生物質乙醇的高值化利用研究中已有諸多應用［13-15］。本研究以楊木為原材料，以Fenton氧化預處理得率和葡萄糖得率作為考察指標，探討H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值及FeCl3濃度對Fenton氧化預處理楊木的影響。在單因素實驗基礎上，利用中心組合-響應面法優(yōu)化了Fenton氧化預處理楊木的工藝條件，以期為生物質材料制備生物質乙醇提供基礎數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1實驗原料

楊木，取自湖北某農(nóng)場，經(jīng)植物粉碎機（FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司）粉碎后取40～60目組分，經(jīng)苯-醇（2∶1，體積比）抽提脫除脂溶物后待用。

1.2實驗方法

1.2.1Fenton氧化預處理

取上述制備的楊木粉10 g加入到500 mL三角瓶中，按固液比為1∶20（m/V）配置預處理液并搖勻，在40℃保溫反應24 h后，進行固液分離并清洗預處理后的固料至中性，將固料放于4℃冰箱內保存?zhèn)溆?，根?jù)式（1）計算Fenton氧化預處理得率。

式中，Y為Fenton氧化預處理得率，%；m1為預處理后固料的質量，g；s1為預處理后固料的含水率，%；10為楊木粉的取樣質量，g；s2為楊木粉的含水率，%。

1.2.1.1單因素實驗

本研究主要考察H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對Fenton氧化預處理得率及葡萄糖得率的影響。單因素實驗中，H2O2/FeCl3分別為5%、10%、25%和75%，pH值分別為1.5、2.0、2.5和3.0，F(xiàn)eCl3濃度分別為10、25、50和75 mmol/L。

1.2.1.2中心組合-響應面實驗設計

通過單因素實驗找出以H2O2/FeCl3、pH值和FeCl3濃度為自變量的中心點。然后以-1、0、1分別說明3個自變量的低、中、高水平進行實驗，計算分析每一預處理條件的得率和葡萄糖得率。以H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度三選二為自變量，以預處理得率和葡萄糖得率為因變量作圖，得到最佳處理條件。設計三因素三水平實驗，具體見表1。

表1 中心組合-響應面實驗因素及水平

1.2.2Fenton氧化預處理楊木的纖維素酶解

稱取0.50 g絕干Fenton氧化預處理后楊木置于50 mL潔凈三角瓶內，纖維素酶加入量為25 FPU/g。使用pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（CH3COOHCH3COONa，0.2 mol/L）配置纖維素酶溶液，并加入1 g/L疊氮鈉抑制微生物的生長。將三角瓶移入ZHWY-2112B搖床中（上海市智誠分析儀器有限公司），反應溫度為50℃，轉速為150 r/min，反應72 h后取一定量的酶解液，在8000 r/min條件下離心5 min，上清液用于葡萄糖得率分析。

1.3分析方法

1.3.1葡萄糖得率的測定

采用高效液相儀（日本島津）測定葡萄糖含量，具體測定條件為：Aminex HPX-87P色譜柱（美國Bio-Rad），柱溫65℃，流動相為超純水，流速為0.6 mL/min，示差檢測器，根據(jù)濃度和峰面積繪制葡萄糖（色譜純）標準曲線。根據(jù)測出的葡萄糖質量計算葡萄糖得率，見式（2）。

式中，C為葡萄糖得率，%；0.50為Fenton氧化預處理后的楊木取樣絕干質量，g；m3為Fenton氧化預處理楊木酶解得到的葡萄糖質量，g。

1.3.2成分分析

木質纖維原料的成分分析測定按照文獻［16］描述的方法進行。本研究所用楊木的成分分析結果如表2所示。

表2 楊木成分分析 %

1.3.3X射線衍射（XRD）分析

采用XRD（荷蘭帕納科銳影）檢測Fenton氧化預處理前后楊木的結晶度，掃描范圍為2θ=10°～50°。

1.3.4比表面積分析

采用ASAP2020物理吸附儀（美國麥克瑞默爾公司），根據(jù)氣體吸附BET法測定樣品的比表面積，測定條件為：脫氣溫度50℃，脫氣時間8 h。具體步驟參見GB/T 19587—2004。

1.3.5掃描電子顯微鏡（SEM）分析

采用SU8010 SEM（日本日立）觀察Fenton氧化預處理前后楊木的微觀形態(tài)，測試前對樣品進行鍍金處理。

2 結果與討論

2.1單因素實驗

研究H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對Fenton氧化預處理楊木葡萄糖得率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，隨著預處理液中H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的增大，葡萄糖得率都呈先上升后下降的趨勢，這一結果與前期其他研究者得到的結果一致。結果表明，當Fe3+濃度達到一定值后，繼續(xù)增加Fe3+的濃度會抑制纖維素酶的活性［10］；此外，高于或低于最佳pH值也會影響Fenton氧化反應［17］。綜上，H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的最佳值分別為10%、2.5和50 mmol/L。

圖1 H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對Fenton氧化預處理楊木葡萄糖得率的影響

2.2中心組合實驗

為了驗證單因素實驗得出的Fenton氧化預處理楊木的最佳條件（H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L），設計中心組合實驗對這一條件進行進一步優(yōu)化。將最佳條件作為中心點條件代入表1中得到所有的預處理條件，具體條件及結果見表3。

表3 Fenton氧化預處理楊木中心組合實驗條件及結果

從表3可以看出，楊木經(jīng)Fenton氧化預處理后得率相差不大，基本都在80%～95%，表明與其他方法相比，F(xiàn)enton氧化預處理可以獲得更高的預處理得率［1，18］。H2O2作為一種強氧化劑，可以氧化脫除木質纖維原料中的組分；由表3可知，當H2O2/FeCl3為5%時，其預處理得率較H2O2/FeCl3為10%和15%時高，說明在Fenton氧化反應中，過量的H2O2會導致纖維素纖維的降解［8］，反而使預處理得率降低。在酸性條件下，F(xiàn)enton氧化預處理可產(chǎn)生高度活性的·OH，因此pH值對Fenton氧化預處理也有較大影響。對比11#、12#和15#3組預處理條件可以發(fā)現(xiàn)，在其他條件相同時，改變Fenton氧化預處理的pH值對預處理得率的影響不大，但總的趨勢是隨著pH值的提高，預處理得率下降。葡萄糖得率受pH值影響較大，當pH值為2.0和3.0時，F(xiàn)enton氧化預處理楊木葡萄糖得率僅為約20%，而pH值為2.5時，葡萄糖得率可增至50%以上，說明在這一pH值條件下，體系中參與Fenton氧化的Fe3+濃度達到了最大值［19］。以上結果說明，以預處理得率和葡萄糖得率為依據(jù)，F(xiàn)enton氧化預處理楊木的最佳條件為H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。

2.3響應面分析

2.3.1響應面法分析Fenton氧化預處理條件對葡萄糖得率的影響

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，運用軟件STATISTICA10.0繪制Fenton氧化預處理條件與葡萄糖得率之間的關系圖，結果如圖2所示。

圖2 Fenton氧化預處理條件對葡萄糖得率影響的響應面圖

從圖2可以看出，隨著H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度的逐漸增大，葡萄糖得率呈先增大后下降的趨勢，在響應面的中心點出現(xiàn)一個最大值，即在中心點處葡萄糖得率最大。在中心點條件下，F(xiàn)enton氧化預處理楊木葡萄糖得率可達51.4%。這一葡萄糖得率是基于初始原料質量計算得到的，如果以原料中聚葡萄糖含量為基準（理論值100%）計算，在中心點條件下，葡萄糖得率可高達理論值的94.7%，遠高于其他預處理方法［1，20-23］，說明Fenton氧化預處理楊木可獲得較高的葡萄糖得率。

用軟件Minitab17分析Fenton氧化預處理條件對葡萄糖得率的影響可知，H2O2/FeCl3對葡萄糖得率影響的p值為0.445（p＞0.1），pH值對葡糖得率影響的p值為0.157（p＞0.1），這兩者p值均大于0.1，說明H2O2/FeCl3和pH值對葡萄糖得率無顯著性影響。而FeCl3濃度對葡萄糖得率影響的p值為0.035（p＜0.05），由此可知，F(xiàn)enton氧化預處理楊木時，F(xiàn)eCl3濃度對葡萄糖得率的影響最顯著。

2.3.2Fenton氧化預處理條件對脫木質素的影響

研究表明，木質素的脫除可以顯著增加木質纖維原料的酶解得率，因為木質素會在酶解過程中對纖維素酶造成無效吸附而降低有效酶活［24-25］。有研究表明，F(xiàn)enton氧化預處理可改變木質纖維原料中木質素的結構性質而增加其酶解效率［7］，因此本研究測定了不同預處理條件對楊木脫木質素的影響，結果見表4。

表4 不同預處理條件對楊木脫木質素的影響

從表4可以看出，經(jīng)Fenton氧化預處理過后，楊木中的木質素有不同程度的脫除。2#預處理條件下木質素脫除率最高，為35.6%；而1#預處理條件下，楊木木質素脫除率不到1%。在最佳預處理條件（15#）下，木質素脫除率為26.1%。雖然前期的研究［26］表明，木質素的脫除有利于纖維素酶解效率的提高，但在本實驗結果中，并未發(fā)現(xiàn)木質素脫除率與葡萄糖得率的直接相關性，說明Fenton氧化預處理提高木質纖維原料的酶解效率不僅在于木質素的脫除，可能還包括原料其他性質的變化，如纖維素結晶度和纖維素聚合度等的改變。

用軟件Minitab17分析Fenton氧化預處理條件對楊木脫木質素的影響可知，H2O2/FeCl3對楊木脫木質素影響的p值為0.012（p＜0.05），pH值對楊木脫木質素影響的p值為0.846（p＞0.1），F(xiàn)eCl3濃度對楊木脫木質素影響的p值為0.324（p＞0.1），由此可知，F(xiàn)enton氧化預處理楊木時，H2O2/FeCl3對脫木質素影響最顯著。

2.4Fenton氧化預處理對楊木性能的影響

2.4.1Fenton氧化預處理對楊木纖維素結晶度的影響

有研究結果表明，木質纖維原料的纖維素結晶度對其酶解性可能有較大的影響，因為無定形區(qū)較結晶區(qū)更容易被酶解。但其他相關研究［27-28］也表明，對于預處理后的木質纖維原料來說，纖維素結晶度對其酶解性能可能沒有影響。Fenton氧化預處理前后楊木的XRD譜圖如圖3所示。由圖3可知，楊木的XRD譜圖呈典型的纖維結構特征。由計算得到，F(xiàn)enton氧化預處理前楊木的纖維素結晶度為39.9%，經(jīng)最佳預處理條件處理后，楊木的纖維素結晶度上升至45.0%，較預處理前提高了12.8%。預處理后木質纖維原料的纖維素結晶度提高在其他研究中也有報道［28-30］。纖維素結晶度的提高說明Fenton氧化預處理主要破壞了楊木纖維中的纖維素無定形區(qū)，脫除了部分半纖維素和木質素［6］；此外，也可能是纖維素發(fā)生氫鍵重排，造成重結晶現(xiàn)象導致的。

圖3 Fenton氧化預處理前后楊木的XRD譜圖

2.4.2Fenton氧化預處理對楊木比表面積的影響

本研究采用氣體吸附BET法測定了Fenton氧化預處理前后楊木的比表面積。實驗結果表明，楊木的比表面積由預處理前的0.91 m2/g增加到預處理后的1.63 m2/g（最佳預處理條件下），較預處理前提高了80.2%。比表面積的增加有利于纖維素酶與底物的接觸，可使更多的纖維素被纖維素酶降解為葡萄糖而提高葡萄糖得率。這與其他研究［28-29］得到的結果一致，即木質纖維原料經(jīng)預處理后，其比表面積的增大與其纖維素轉化率的增加有正相關關系。

2.4.3Fenton氧化預處理對楊木表面形態(tài)的影響

Fenton氧化預處理前后楊木的SEM圖如圖4所示。從圖4可以看出，未經(jīng)過預處理的楊木，其表面平滑、致密有序，說明細胞壁中的纖維素、半纖維素和木質素相互交織在一起。Fenton氧化預處理后的楊木表面變得比較粗糙，有裂痕以及孔洞的存在，結構變得松散。另外，楊木的表面出現(xiàn)了大量的凹陷和裂痕，這在一定程度上提高了物料的比表面積，增加了纖維素酶分子與纖維素的接觸位點，從而促進纖維素酶對纖維素的降解。

綜上可知，經(jīng)Fenton氧化預處理后，楊木的纖維素結晶度提高，比表面積增加，且結構變得粗糙松散。其中，楊木比表面積的增大和結構的改變可能增加了纖維素酶與纖維素的作用位點和可及度，促進了纖維素酶對楊木纖維的酶解程度，最終提高了葡萄糖得率。

圖4 （a，c）未處理楊木和（b，d）Fenton氧化預處理楊木的SEM圖

3 結論

以楊木為原料，通過單因素實驗（H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值和FeCl3濃度）及中心組合-響應面法優(yōu)化了Fenton氧化預處理楊木的最佳條件。采用成分分析、X射線衍射（XRD）、比表面積分析及掃描電子顯微鏡（SEM）對預處理前后的楊木進行了表征，主要結論如下。

3.1Fenton氧化預處理楊木的最佳條件為：H2O2/Fe-Cl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。在最佳預處理條件下，楊木的葡萄糖得率可達51.4%，為理論值的94.7%。

3.2通過Minitab17軟件分析得到FeCl3濃度對Fenton氧化預處理楊木葡萄糖得率的影響最顯著，H2O2/FeCl3對脫木質素影響最顯著。

3.3Fenton氧化預處理過程中脫除了部分木質素，在最佳預處理條件下，木質素脫除率達到26.1%。Fenton氧化預處理提高了楊木的纖維素結晶度（由預處理前的39.9%提高至45.0%）和比表面積（由預處理前的0.91 m2/g提高至1.63 m2/g）。楊木比表面積的增大和表面結構的改變促進了纖維素的酶降解，提高了Fenton氧化預處理楊木的葡萄糖得率。