基于OPG/RANKL/RANK軸觀察加味陽和湯及其拆方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響

曹端廣 楊文龍 夏漢庭 吳凡 許權(quán) 楊鳳云*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000

骨質(zhì)疏松癥是指骨吸收大于骨形成，全身骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞的一種代謝性骨病。我國約有7 000萬人患有骨質(zhì)疏松癥，約有2億人存在不同程度的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨礦含量(bone mineral content，BMC)下降[1]。更年期后，婦女雌激素水平下降，松質(zhì)骨退變，骨量下降，最有效的治療方法就是補充雌激素，然而過量雌激素易使女性子宮出血、心血管等疾病的風險增加[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥療效可靠，毒副作用小，可能是一種可行的替代方法。補腎活血類中藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)取得了理想的療效，可以防止患者BMD下降[3-4]；OPG/RANKL/RANK軸能調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成，是維持人體骨量平衡的重要通路。前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，加味陽和湯對維甲酸所致藥物性大鼠骨質(zhì)疏松癥有良好的防治作用，然而對加味陽和湯組方配伍合理性及對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的作用效果及可能機制，卻未見相關(guān)報道。因此，本研究通過檢測加味陽和湯干預(yù)后去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的BMD、BMC、骨顯微結(jié)構(gòu)及血清學(xué)指標，研究加味陽和湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用，探討其可能的作用機制及組方配伍的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：雌性SD大鼠48只，3月齡，質(zhì)量為(225±5)g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(贛)2018-0003。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(SHAM)、模型組(OVX)、君藥+臣藥組(A組)、君藥+臣藥+佐藥組(B組)、君藥+臣藥+佐藥+使藥組(C組)、戊酸雌二醇組(estradiol valerate，E2V)組，每組8只。

1.1.2主要藥物：熟地黃15 g、鹿角膠10 g(另烊化)為君，肉桂10 g、炮姜6 g為臣，白芥子10 g、麻黃10 g、雞血藤20 g、漢防己10 g為佐，木瓜6 g、甘草3 g為使，共10味中藥，A組、B組、C組的用藥經(jīng)煎煮后分別濃縮至含生藥濃度0.41 g/mL、0.91 g/mL、1 g/mL。

1.2 方法

1.2.1動物造模：造模方法參照參考文獻[6]，除SHAM組外，其余各組均摘除卵巢，制作去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型。

1.2.2造模干預(yù)：各組大鼠于術(shù)后2周開始干預(yù)，SHAM組、OVX組用等量生理鹽水灌胃，A組、B組、C組分別用不同濃度中藥灌胃，陽性藥物組將E2V按0.2 mg /kg灌胃，100 g/mL持續(xù)灌胃90 d。

1.2.3動物取材:藥物干預(yù)結(jié)束后處死動物，取右側(cè)股骨及脛骨測定BMD、BMC，左側(cè)股骨制作病理組織HE染色切片，分離血清備用。

1.2.4BMD及BMC測定:采用美國Hologic Discovery W型雙能X射線骨密度儀，對大鼠股骨、脛骨行單根擺放骨密度掃描。

1.2.5骨組織HE染色：甲醛固定，脫鈣，常規(guī)包埋、石蠟切片脫蠟至水洗、蘇木素染色、伊紅復(fù)染、脫水封片，顯微鏡鏡檢。

1.2.6血清指標檢測：送入江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，檢測Ca2+、P3-、ALP、E2含量。采用ELISA檢測試劑盒，按說明書要求檢測OPG、RANKL、RANK含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨及脛骨BMD、BMC含量比較

與SHAM組比較，除C組股骨BMD、陽性藥物組股骨及脛骨BMD無顯著差異外(P>0.05)，OVX組及各給藥組股骨及脛骨BMD、BMC均明顯降低(P<0.05)；與 OVX 組比較，除A組股骨及脛骨BMD、股骨BMC無顯著差異(P>0.05)外，各給藥組的股骨及脛骨BMD、BMC均不同程度升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠股骨及脛骨的骨密度和骨礦物質(zhì)含量Table 1 Bone mineral density and bone mineral content in the femur and tibia of rats in each

2.2 各組骨顯微結(jié)構(gòu)比較

骨組織切片檢查示，SHAM組骨小梁粗細均勻，結(jié)構(gòu)完整，間隙??；與OVX組相比，各給藥組骨組織形態(tài)均有不同程度的改善，OVX組和A組骨髓腔變大，骨小梁變細、間隙增大，結(jié)構(gòu)缺失嚴重，B組骨小梁增多、疏松，但結(jié)構(gòu)仍不完整，C組和陽性藥物組骨皮質(zhì)與骨髓分界清晰、結(jié)構(gòu)完整，基本接近正常。見圖1。

圖1 加味陽和湯對骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of Jiaweiyanghe decoction on the histomorphology of the osteoporotic rat femur

2.3 各組骨代謝指標比較

與SHAM組比較，除陽性藥物組P3-無顯著差異外(P>0.05)，OVX組及各給藥組血清Ca2+、P3-、E2 均明顯降低(P<0.05)，ALP均明顯升高(P<0.05)；與OVX組比較，A組對Ca2+、P3-、E2及B組對P3-水平均有升高作用，但無顯著差異(P>0.05)，其余各給藥組均能顯著升高血清Ca2+、P3-、E2同時降低ALP(P<0.05)。見表2。

表2 各組中大鼠血清Ca2+、P3-、ALP、E2的水平Table 2 Serum levels of Ca2+, P3-, ALP, and E2 in each rat

2.4 各組血清OPG、RANKL、RANK水平比較

與SHAM組比較，除與陽性藥物組RANK上升但無顯著差異外(P>0.05)，OVX組及各給藥組大鼠血清 OPG均明顯降低(P<0.05)，RANKL、RANK均明顯升高(P<0.05)；與OVX組比較，A組對OPG水平具有升高作用，同時可抑制RANKL，但無顯著差異(P>0.05)，其余各給藥組均能顯著降低血清RANKL、RANK同時升高OPG (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清OPG、RANKL、RANK水平比較Table 3 Comparison of serum levels of OPG, RANKL, and RANK between each rat

3 討論

去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠模型，類似于人PMOP狀態(tài)，穩(wěn)定，成功率高，常用于PMOP動物模型的制作[7]。中醫(yī)認為骨質(zhì)疏松癥為“骨萎”，治療中主要以補腎精、益骨髓為主。加味陽和湯是江西中醫(yī)藥大學(xué)許鴻照教授針對PMOP患者在陽和湯基礎(chǔ)上加味雞血藤、漢防己、木瓜而來的經(jīng)驗名方，有益骨髓、補肝腎、活血絡(luò)之功。鹿角膠組能抑制破骨細胞增殖, 抑制骨吸收；雞血藤能促進MC3TW-E1細胞增殖, 提高細胞ALP活性[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，OVX組大鼠股骨及脛骨BMD、BMC降低，骨小梁變細、間隙增大、結(jié)構(gòu)缺失，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。各給藥組大鼠股骨及脛骨BMD、BMC均不同程度的升高，骨小梁增粗，間隙減小，說明加味陽和湯及其拆方能增強去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨骼強度，提高骨量。測定骨形成標志物ALP和Ca2+、P3-、E2能有效的反映骨代謝情況[10-12]，實驗結(jié)果顯示，OVX組大鼠血清Ca2+、P3-、E2下降，ALP上升，提示去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨礦沉積不足，骨形成減少，骨代謝活躍，骨量丟失，符合人PMOP狀態(tài)。各給藥組大鼠血清Ca2+、P3-、E2均不同程度上升，同時均可降低ALP，揭示加味陽和湯及其拆方具有類雌激素樣作用，可不同程度的加速骨礦物質(zhì)的沉積，促進骨形成，降低骨代謝，抑制骨量丟失，其中A組對骨代謝有一定影響但無明顯差異。

PMOP的發(fā)生與OPG/RANKL/RANK軸關(guān)系密切，PMOP患者由于雌激素水平下降，使得體內(nèi)OPG的表達降低，RANKL、RANK表達升高，破骨細胞數(shù)量增加，骨吸收加快[13-16]。實驗結(jié)果顯示，OVX組大鼠血清OPG下降，血清RANKL、RANK上升，各給藥組大鼠血清OPG水平均不同程度上升，血清RANKL、RANK水平均不同程度下降，提示加味陽和湯及其拆方防治PMOP可能的機制是調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK軸，從而調(diào)控成骨及破骨細胞，抑制骨吸收，減少骨量丟失。

多數(shù)學(xué)者對中藥治療骨萎病的研究[17]集中于補益肝腎中藥，對活血及引經(jīng)調(diào)和中藥、中藥復(fù)方中君臣佐使相互配伍之后“藥力”的表達研究較少。因此，加味陽和湯中補益肝腎中藥及其配伍活血及引經(jīng)調(diào)和中藥后治療PMOP是否會使藥物的療效得以增強、加味陽和湯中君臣佐使相互配伍之后“藥力”是否得到了充分表達、PMOP的發(fā)生與OPG/RANKL/RANK軸之間的關(guān)系等，基于OPG/RANKL/RANK軸觀察加味陽和湯及其拆方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響則能很好的探討上述問題。

綜上所述，加味陽和湯能夠通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK軸，提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BMD、BMC，降低骨代謝，改善骨顯微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療作用。加味陽和湯及其拆方抗骨質(zhì)疏松作用為C組>B組>A組，在君臣藥的基礎(chǔ)上，配伍佐藥及使藥后能顯著增強抗骨質(zhì)疏松作用，其作用機制可能是在君臣藥補腎溫陽基礎(chǔ)上與活血中藥相配合并輔以引經(jīng)調(diào)和中藥，能更好的延緩骨量丟失,防治PMOP。加味陽和湯防治PMOP，具體的影響機制還不明確，且中藥復(fù)方具有多通路、多靶點的特點，可能還具有其它作用機制；采用不同的拆方方式使加味陽和湯中有效中藥得以進一步篩選，縮小尋找治療PMOP有效藥物的范圍，這些均是本課題組以后工作的重點。