VEGF復(fù)合透明質(zhì)酸鈉對(duì)異體BPTB重建兔前交叉韌帶再血管化的影響

陳加榮，沈洪園，李憑躍

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對(duì)維持膝關(guān)節(jié)功能極為重要。ACL斷裂常導(dǎo)致嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，或繼發(fā)膝關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及半月板損傷，其有效治療方法是進(jìn)行ACL重建[1]。目前，同種異體骨-髕腱-骨（bone-patellar tendon-bone，BPTB）是重建ACL的常用肌腱移植物[2]，重建術(shù)后這些移植物將經(jīng)歷壞死、細(xì)胞長(zhǎng)入和塑形的過程[3]。移植物再血管化直接影響細(xì)胞長(zhǎng)入及塑形過程，最終影響移植物生物力學(xué)特性的恢復(fù)，是決定移植物成活質(zhì)量的關(guān)鍵因素[4]。

血管生成相關(guān)因子在血管化過程中發(fā)揮重要作用，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是已知活性最強(qiáng)、特異性最高的血管生成因子[5]，其他血管生成因子大都通過增強(qiáng)VEGF表達(dá)來發(fā)揮作用。但單純VEGF在體內(nèi)擴(kuò)散快，易被蛋白酶分解而喪失生物學(xué)效應(yīng)。因此，尋找一種能夠保證VEGF緩慢釋放并發(fā)揮作用的無免疫原性載體系統(tǒng)，能更好地促進(jìn)血管和細(xì)胞長(zhǎng)入，提高移植物的成活質(zhì)量。

作為一種藥物緩釋劑，透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）可延緩藥物的釋放速度，對(duì)一些生物大分子藥物還可能具有生物黏附作用[6]。本研究探討VEGF復(fù)合SH對(duì)同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后再血管化的影響，為提高ACL重建術(shù)后移植物愈合質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

重組人VEGF（PeproTech公司，美國）；小鼠抗人CD31單克隆抗體（Neomaker公司，美國）；SH（Sigma公司，美國）；FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋公司）；4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）穿細(xì)胞膜藍(lán)色熒光染料C1002（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；PBS液（Gibco公司，美國）；速眠新Ⅱ注射液（吉林圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司）。Olympus BX51研究級(jí)正置顯微鏡（Olympus公司，美國）；Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics Inc，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康成熟新西蘭大白兔由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK 2019-0100），平均體重2～3 kg，6～8月齡，雌雄不限。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 同種異體BPTB移植物制備 12只成熟新西蘭大白兔于取材前30 min以速眠新Ⅱ注射液（0.1 g/kg）肌注麻醉。固定后雙后肢脫毛，常規(guī)消毒鋪巾。取髕前內(nèi)側(cè)切口，顯露髕腱，切斷髕骨側(cè)連帶部分股四頭肌腱，脛骨側(cè)鋸斷脛骨連同其前部約1.5 cm骨組織，止血后逐層閉合創(chuàng)口。將獲取的BPTB進(jìn)一步修整成股骨段骨長(zhǎng)1 cm、寬4 mm，脛骨段骨長(zhǎng)1 cm、寬4 mm，髕腱寬4 mm。以Co射線處理后裝入無菌瓶中，置于-80℃深低溫冰箱保存3個(gè)月以上待用。

1.3.2 同種異體BPTB術(shù)前處理 術(shù)前30 min向裝有同種異體BPTB移植物的無菌瓶?jī)?nèi)，分別注入30 mL VEGF 溶液（30 μg/mL）、30 mL SH溶液（100 μg/mL）、15 mL SH溶液（100 μg/mL）和15 mL VEGF溶液（30 μg/mL）、30 mL PBS溶液。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及同種異體BPTB重建ACL動(dòng)物模型制作 將24只新西蘭大白兔隨機(jī)分成A、B兩組，每組12只，雙膝均用于實(shí)驗(yàn)。麻醉、肢體固定及消毒方法與前述移植物取材制備步驟相同。取髕前內(nèi)側(cè)切口，將髕骨向外側(cè)脫位，暴露ACL并剪斷。鉆頭于ACL脛骨止點(diǎn)依次鉆出脛骨隧道和股骨隧道。

A組（24膝）隨機(jī)選擇兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)植入前述經(jīng)VEGF、SH復(fù)合處理的BPTB（SH-VEGF組），另一側(cè)植入僅由PBS處理的BPTB（空白對(duì)照組）；B組（24膝）同法隨機(jī)選擇兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)植入經(jīng)VEGF處理的BPTB（VEGF組），另一側(cè)植入經(jīng)SH處理的BPTB（SH組）。

將BPTB由任一端穿過骨隧道后牢固縫合于骨隧道口周圍筋膜組織上，懸吊式固定，徹底止血后逐層閉合創(chuàng)口。術(shù)后所有術(shù)肢均不予固定，自由活動(dòng)，予青霉素10萬U/kg，2次/d，連續(xù)注射3 d。分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。術(shù)后2、4、8周A、B兩組分別安樂處死4只新西蘭大白兔。

1.4 觀察及評(píng)估指標(biāo)

術(shù)后2、4、8周處死動(dòng)物后對(duì)其雙膝關(guān)節(jié)進(jìn)行解剖，觀察移植物表面及腱骨表面血管化情況。

對(duì)移植物進(jìn)行蘇木精-伊紅染色及血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記抗體CD31免疫組化染色，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及分布；100倍光鏡下觀察免疫組化切片中移植物新生血管分布的大致規(guī)律，400倍光鏡下隨機(jī)選取50個(gè)視野進(jìn)行圖像分析，運(yùn)用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)算平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，手術(shù)前后比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，各組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 解剖學(xué)大體觀察

不同時(shí)相點(diǎn)關(guān)節(jié)內(nèi)BPTB移植物均為白色致密纖維束狀結(jié)構(gòu)（圖1A）。術(shù)后2周，SH組、空白對(duì)照組移植物表面未見明顯滑膜包裹；VEGF組、SH-VEGF組可見移植物脛骨端、股骨端有少量滑膜包裹（圖1B），隧道內(nèi)移植物與骨道壁之間以疤痕組織相連。

術(shù)后4周，SH組、空白對(duì)照組移植物表面有少量血管及滑膜包裹，以脛骨端與股骨端為主；VEGF組兩端及體部均有部分滑膜包裹，隧道內(nèi)口及隧道內(nèi)疤痕組織密集，移植物被疤痕組織包繞，難以分離，移植物與骨隧道之間仍有縫隙；SH-VEGF組移植物骨端可見大量血管及滑膜包裹，體部有部分滑膜包裹，骨隧道內(nèi)口連接緊密，隧道內(nèi)可見沿骨隧道排列的軟骨樣組織，移植物與骨隧道之間無縫隙，形成穩(wěn)定的組織連接（圖1C）。

術(shù)后8周，SH組、空白對(duì)照組兩骨端有大量滑膜包裹，隧道內(nèi)口見少量疤痕組織，部分隧道內(nèi)口呈橢圓形，移植物與隧道壁之間充滿疤痕組織；VEGF組、SH-VEGF組兩骨端滑膜較4周前減少，移植物與骨隧道間填充大量軟骨樣組織，連接緊密（圖1D）。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 蘇木精-伊紅染色 術(shù)后2周，各組BPTB移植物表面已覆蓋部分血管內(nèi)皮細(xì)胞，但SH組、空白對(duì)照組細(xì)胞量較少，移植物深部未見明顯血管形成；術(shù)后4周，血管內(nèi)皮細(xì)胞由移植物表面逐漸進(jìn)入深部（圖2A），進(jìn)入深部的細(xì)胞數(shù)量SH組和空白對(duì)照組遠(yuǎn)少于VEGF組和SH-VEGF組；術(shù)后8周，4組細(xì)胞均到達(dá)移植物深部，且初步形成管腔樣結(jié)構(gòu)（圖2B）。

圖1 SH-VEGF組移植物大體解剖觀察 1A完整取出，為白色致密纖維束狀結(jié)構(gòu) 1B術(shù)后2周 1C術(shù)后4周 1D術(shù)后8周

2.2.2 免疫組化染色 術(shù)后2周，SH組、空白對(duì)照組移植物CD31免疫組化染色可見極少量棕色顆粒；VEGF組移植物脛骨端與股骨端有較多散在棕色顆粒著色，未見血管腔形成；SH-VEGF組可見少量血管腔形成。術(shù)后4周，SH組、空白對(duì)照組移植物有少量棕色顆粒著色，在脛骨端與股骨端可見少量血管腔形成，SH-VEGF組移植物陽性著色由兩端向體部逐步長(zhǎng)入（圖2C）。術(shù)后8周，空白對(duì)照組移植物脛骨端、股骨端有較多棕色顆粒著色，可見血管腔形成，體部邊緣有少量散在棕色顆粒，向深部逐步減少；SH-VEGF組可見移植物脛骨端、股骨端血管較4周前減少，體部深部可見較多散在棕色染色，并有血管腔形成（圖2D）。

2.2.3 CD31染色灰度值 如表1所示，術(shù)后2、4及8周SH-VEGF組、VEGF組、SH組及空白對(duì)照組之間灰度值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后2、4、8周SH-VEGF組CD31陽性細(xì)胞多于其他3組，VEGF組高于SH組及空白對(duì)照組（P＜0.05），而術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)SH組與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 SH-VEGF組移植物組織學(xué)觀察（×400）2A，2B 蘇木精-伊紅染色 2C，2D CD31免疫組化染色

表1 同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后移植物CD31染色灰度值（±s，n=4）

表1 同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后移植物CD31染色灰度值（±s，n=4）

注：BPTB：骨-髕腱-骨；ACL：前交叉韌帶；SH：透明質(zhì)酸鈉；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；*與SH-VEGF組相比，P ＜0.05；#與VEGF組相比，P ＜0.05；

組別SH-VEGF組VEGF組SH組空白對(duì)照組F值P值2周79.1±7.9 63.4±8.5*21.4±5.1*#20.9±6.1*#37.568 0.006 4周198.7±9.0 88.3±4.8*49.2±4.3*#49.5±3.2*#28.783 0.008 8周126.6±7.7 126.6±3.6*95.0±10.3*#84.9±4.5*#51.022 0.001 F值33.086 50.076 35.089 31.011 P值0.005 0.001 0.005 0.005

術(shù)后4周各組灰度值均高于術(shù)后2周，術(shù)后8周SH-VEGF組灰度值較4周有所下降，而其他3組術(shù)后8周灰度值均較術(shù)后4周時(shí)有所上升（P＜0.01）。

如圖3所示，VEGF組、SH組及空白對(duì)照組在術(shù)后隨時(shí)間推移，平均灰度值逐漸增加；SH組與空白對(duì)照組無明顯差異；SH-VEGF組先增后減，峰值出現(xiàn)在術(shù)后4周。

3 討論

3.1 同種異體BPTB的處理

同種異體韌帶和肌腱組織的抗原性主要來自于纖維細(xì)胞上的主要組織相容性抗原。異體韌帶經(jīng)深低溫冷凍處理后其主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）遭到破壞，移植物抗原性有所降低[7]。Arnoczky等[8]對(duì)新鮮及低溫冰凍處理后BPTB進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)前者排斥反應(yīng)明顯，后者排斥反應(yīng)不明顯。張培等[9]運(yùn)用深低溫冷凍異體ACL進(jìn)行移植，術(shù)后未檢測(cè)到任何免疫排斥反應(yīng)；有學(xué)者將手、肩及膝關(guān)節(jié)等部位的冷凍異體軟組織用于移植，未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)[10-11]；Shino等[12]應(yīng)用低溫冷凍保存的BPTB異體移植重建ACL，也未檢測(cè)到任何排斥現(xiàn)象。但Pinkowski等[11]對(duì)低溫冷凍同種異體髕腱移植重建ACL患者進(jìn)行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例嚴(yán)重排斥反應(yīng)。本研究所用同種異體BPTB均在-80℃深低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存3個(gè)月，目的就是為了徹底破壞細(xì)胞成分并降低抗原性，盡量減少排斥反應(yīng)對(duì)再血管化可能造成的影響。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)移植物CD31染色平均灰度值變化趨勢(shì)

3.2 生長(zhǎng)因子VEGF與韌帶愈合

韌帶愈合是由許多分子啟動(dòng)、控制、終止的復(fù)雜過程，多種生長(zhǎng)因子在韌帶正常愈合過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。VEGF是1989年Ferrara和Henzel[15]在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化出來的一種糖蛋白，其主要生物學(xué)功能是促進(jìn)新生血管形成和增加血管通透性。正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞并不表達(dá)VEGF，缺氧時(shí)可迅速誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達(dá)。在正常氧狀態(tài)下，VEGF半衰期是30～45 min，轉(zhuǎn)變?yōu)榈脱鯛顟B(tài)后半衰期可延長(zhǎng)至6～8 h。

本實(shí)驗(yàn)中VEGF在兔體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物學(xué)效應(yīng)。免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)合30 μg/mL VEGF溶液組BPTB移植重建ACL后，無論在新血管形成時(shí)間、數(shù)量，還是血管長(zhǎng)入韌帶的時(shí)間、深度，都優(yōu)于空白對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SH-VEGF染色組血管形成高峰期在第4周，第8周已呈下降趨勢(shì)，原因可能有以下三方面：①一次性外源VEGF的生物學(xué)效應(yīng)消失；②機(jī)體自身調(diào)節(jié)作用；③正常ACL內(nèi)缺乏血管，新生血管必然退化。而VEGF組則可能由于一次性外源性VEGF過早失效，其血管形成與對(duì)照組相似，相對(duì)延后。

3.3 SH-VEGF的促移植物血管化作用

作為藥物制劑輔料，SH及其鈉鹽是人體自身固有物質(zhì)，具有良好的可吸收性、生物相容性和黏膜黏附性，可以抑制藥物的擴(kuò)散、沉降和對(duì)流，并黏附在作用部位，緩慢釋放藥物作用。Matsumoto等[16]在嗎啡腸道栓劑中加入3%SH，經(jīng)兔直腸給藥后發(fā)現(xiàn)，該栓劑具有緩釋作用；Surendrakumar等[17]將10%（w/w）重組人胰島素加入SH并噴霧干燥成可吸入性微粒，犬吸入后胰島素平均停留時(shí)間和半衰期均較單純胰島素干燥微粒長(zhǎng)；SH還可通過共價(jià)鍵修飾脂質(zhì)體，借助吸附、靜電作用包裹納米球，從而延長(zhǎng)藥效，滿足緩釋要求。

研究表明，聯(lián)合使用具有緩釋作用的SH，VEGF可能更接近生理濃度，并持續(xù)促進(jìn)血管再生形成[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，VEGF復(fù)合SH后對(duì)移植物新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于單純VEGF組，而單純SH組與空白對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05），說明在VEGF中加入SH能促進(jìn)移植物的血管化，而這種促再血管化作用并不是單純由SH引起的，其與VEGF之間可能存在協(xié)同作用。課題組下一步將對(duì)SH與VEGF之間的具體結(jié)合方式及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。