外源性雌孕激素聯(lián)合給藥誘導雌性大鼠人工動情周期的方法學探討

劉 坤 王玉杰 李亞瓊 張 浩 張勝男 魏 盛

雌性性成熟大鼠規(guī)律的動情周期一般為4～5天，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期[1]。在動情周期的不同階段大鼠的生殖及內分泌系統(tǒng)會發(fā)生組織學與生理學上的變化[2]。動情周期規(guī)律的雌性大鼠作為一種動物模型在探索女性月經(jīng)周期相關疾病的發(fā)生機制、評價藥物的作用效果以及相應藥物開發(fā)的實驗中應用廣泛。但自然狀態(tài)下動情周期規(guī)律的雌性大鼠只占10%左右，并且其動情周期并不同步，極大干擾了相關研究工作的進行[3]。探索人工誘導雌性大鼠動情周期的方法可以在誘導大鼠規(guī)律動情周期的同時保證其同步性，以便于在進行動物數(shù)量較多的實驗中進行平行對照。同時，通過掌握對大鼠進行激素誘導的時間可推斷大鼠所處動情周期的階段，避免了在確定大鼠動情周期的階段時進行的實驗操作并可以減少其對大鼠的刺激與影響。此方法在實驗研究中無疑具有重要的應用價值。

人工誘導雌性大鼠動情周期的方法在國內外鮮有報道。Ho等[4]通過注射苯甲酸雌二醇、雌二醇和孕酮的方式成功誘導出與正常雌性大鼠陰道的周期性改變一致的動物模型，并運用于PMS大鼠模型的制備中，驗證了此種方法的可靠性。筆者課題組在前期的研究中已經(jīng)證實此種方法可以誘導出動情周期規(guī)律且同步的大鼠，本實驗在前期經(jīng)驗的基礎上將溶解的溶劑由麻油改為二甲基亞砜(DMSO)，以解決激素在麻油中不能充分溶解的問題，應用于大鼠動情周期的人工誘導中。

本研究用陰道電阻儀檢測大鼠陰道電阻值，將動情周期規(guī)律與不規(guī)律的大鼠分為兩組(將動情周期規(guī)律的大鼠組作為對照)，均進行卵巢切除術后行雌、孕激素聯(lián)合給藥以人工誘導大鼠同步且規(guī)律的動情周期，為相關的實驗提供可靠的大鼠模型。

材料與方法

1.實驗動物：100只SPF級雌性性成熟Wistar大鼠，6～8周齡，體質量120～160g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006]。進入實驗室后，所有大鼠均在屏障環(huán)境[使用許可證號：SYXK(魯)2017-0022]中單籠飼養(yǎng)，保持12h/12h明暗周期，晝夜顛倒(8:00時關燈，20:00時開燈)。飼養(yǎng)大鼠房間保持室溫21±1℃，相對濕度45%，自由采食和飲水。實驗前進行7天的適應性飼養(yǎng)以適應環(huán)境，定時進行抓握以平行操作[5]。所有實驗操作遵從于美國NIH頒布的《實驗動物護理和使用指南》，并由山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(批準號：DWSY201703013)。

2.器材和試劑：大鼠受孕期分析儀(MK-11)購自室町機械株式會社；苯甲酸雌二醇、雌二醇購自麥克林(上海)貿易有限公司；孕酮購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；青霉素鉀購自江蘇南農高科動物藥業(yè)有限公司；水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司。苯甲酸雌二醇(0.5微克/只)、雌二醇(0.5微克/只)、孕酮(0.5毫克/只)在使用前用DMSO溶劑配成相應濃度溶液，青霉素鉀使用前用0.9%氯化鈉注射液配成相應濃度溶液(2單位/只)，水合氯醛使用前用0.9%氯化鈉注射液配成10%濃度溶液。

3.陰道電阻法檢測大鼠動情周期并根據(jù)動情周期是否規(guī)律對大鼠進行分組:通過測量大鼠的陰道電阻值并觀察其變化趨勢可以判斷大鼠的動情周期是否規(guī)律。動情周期規(guī)律大鼠的陰道電阻值滿足以4天為1個周期，且非接受期(動情后期、動情間期)陰道電阻值<3kΩ,接受期(動情前期、動情期)陰道電阻值≥3kΩ的規(guī)律。對實驗的100只雌性成熟Wistar大鼠進行陰道電阻值測量。正常大鼠的動情周期一般為4天，少數(shù)為5天。因此陰道電阻值至少需測量兩個周期，即9天左右。為避免測量時間不合適導致數(shù)據(jù)偏差及傍晚測量造成假孕，陰道電阻的測量時間選擇在下午13:00時～15:00時。陰道電阻測量方法：打開大鼠受孕分析儀電源開關，檢查設備相關狀況，確認設備初始值為10.00kΩ后，用0.9%氯化鈉注射液清洗陰道探頭并消毒，放置在一側待用。左手抓取大鼠，將其頭部置于中指和示指之間，使其處于仰臥位，抓握大鼠時應盡量保持動作輕柔溫和，減少大鼠的痛苦[6]。待大鼠四肢放松在最舒適狀態(tài)時進行測量。將陰道探針輕輕的插入大鼠陰道內約30s測量陰道電阻，每次測量前用0.9%氯化鈉注射液清洗。待電阻儀顯示數(shù)值穩(wěn)定后讀取數(shù)據(jù)并做好記錄。測定完成，檢查儀器正常，關閉電源并消毒探針。

4.卵巢切除術后雌孕激素聯(lián)合給藥誘導：進行陰道電阻值測量后，通過觀察大鼠陰道電阻值的特點將大鼠分為兩組，10只為動情周期規(guī)律的大鼠，90只為動情周期不規(guī)律的大鼠，為驗證激素誘導實驗的可靠性，筆者對兩組大鼠均進行了卵巢切除術后的雌孕激素聯(lián)合誘導。

(1)卵巢切除術：術前大鼠禁食禁水(12h)。用水合氯醛(10%)按照3ml/kg劑量注射進行麻醉。麻醉指征：呼吸平穩(wěn)、角膜反射小或遲鈍、皮膚夾捏反應消失、全身肌肉松弛。仰臥位固定大鼠四肢。以腹正中線距離陰道口2.5cm處為中心，半徑1.5cm的范圍用剪刀剪掉大鼠皮毛，碘伏消毒。在低于觸診肋骨的1.5cm處做一切口，逐層鈍性分離,進入腹腔，使用彎鑷從切口處向腹腔下方找到子宮角，順著子宮可以慢慢拉出脂肪包裹呈粉紅色桑葚狀的卵巢，然后在大鼠卵巢與輸卵管相交部位0.5～1.0cm處按照縫合打結的方法進行結扎，結扎完成剪下大鼠卵巢[7]。青霉素消炎后將子宮送回腹腔，分層縫合后青霉素消炎，術后恢復1周。卵巢摘除后的大鼠于每天下午的14：00、15：00、16：00、17：00時檢測陰道電阻，檢測1個動情周期。

(2)激素誘導：卵巢切除術后的大鼠于0h(第1次皮下注射激素作為計時開始)、32h、44h分別皮下注射苯甲酸雌二醇、雌二醇、孕酮[4]。第1次注射激素時間(即0h)選擇在中午11:30時注射苯甲酸雌二醇，32h后即第2天下午19:30時注射雌二醇，44h即第3天早上7:30時注射孕酮，第4天不注射。連續(xù)激素誘導兩個動情周期，檢測此期間大鼠陰道電阻值。注射時左手拇指和示指揪起背部皮膚1cm左右，手掌蒙住大鼠眼睛并起固定作用，右手持針從揪起的兩層皮膚中間進針，保持進針方向與皮膚平行，感覺到針尖傳來突破感即針尖穿破皮質，此時便可推動注射器注入激素。注射激素過程中要確保針尖在皮膚里，防止用力過大導致針尖穿透兩層皮膚而刺出皮膚外。

5.統(tǒng)計學方法：采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述。

結 果

1.陰道電阻法檢測大鼠動情周期的結果:動情周期規(guī)律大鼠各時期陰道表皮細胞的電阻值符合一定規(guī)律：滿足4天1個周期循環(huán)，且接受期電阻值≥3kΩ，非接受期電阻值<3kΩ, 說明大鼠動情周期規(guī)律(圖1)。動情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值曲線未呈現(xiàn)共同的電阻值變化規(guī)律，因此筆者列舉了兩種典型的電阻圖情況。大鼠的陰道電阻值保持<3kΩ的水平而無周期性波動(圖2A)；大鼠的陰道電阻值僅出現(xiàn)一個動情周期而無連續(xù)的周期性變化(圖2B)。此類大鼠的動情周期不規(guī)律。

圖1 動情周期規(guī)律大鼠陰道電阻波動情況(n=10)此圖對動情周期規(guī)律大鼠不同時間測得的陰道電阻值進行了同步化調整

圖2 動情周期不規(guī)律大鼠兩種典型的陰道電阻波動情況A.大鼠的陰道電阻值保持<3kΩ的水平而無周期性波動;B.大鼠的陰道電阻值僅出現(xiàn)一個動情周期而無連續(xù)的周期性變化

2.卵巢切除后大鼠的陰道電阻值結果:連續(xù)檢測5天卵巢切除后的大鼠的陰道電阻值，陰道電阻值失去周期性變化，且處于<3kΩ的水平(圖3)。

圖3 卵巢切除后大鼠的陰道電阻波動情況(n=100)

3.激素誘導后大鼠的陰道電阻值結果:由圖4中電阻值的變化規(guī)律可知，進行雌孕激素誘導后兩組大鼠的陰道電阻值均出現(xiàn)以4天為1個周期，連續(xù)兩個周期的動情周期變化趨勢。其第1、2、4天陰道電阻值<3kΩ,第3天≥3kΩ，證明外源性雌孕激素聯(lián)合給藥可以誘導雌性大鼠規(guī)律且同步的動情周期。

討 論

雌性性成熟大鼠動情周期的變化與其體內卵巢分泌雌孕激素的狀況密切相關。卵巢內性激素導致的卵泡和黃體發(fā)生的一系列變化對應了大鼠動情周期的不同階段。本實驗依據(jù)動情周期與雌孕激素的相關性，通過雌孕激素聯(lián)合給藥的方法誘導雌性大鼠的人工周期，為相關研究提供可靠的大鼠模型。

圖4 激素誘導兩個周期后大鼠的陰道電阻波動情況(n=100)A.動情周期規(guī)律大鼠；B.動情周期不規(guī)律大鼠

Iwasaki等[8]的研究指出由陰道電阻法測得大鼠的陰道電阻值與大鼠動情周期的相關性較高。Jaramillo等[6]通過檢測大鼠陰道電阻值的方法確定了大鼠的動情前期，提出此種方法準確率高，并可以降低大鼠假孕的概率。在使用陰道電阻值篩選動情周期規(guī)律的大鼠時，合格大鼠的陰道電阻圖呈現(xiàn)動情周期持續(xù)4天，接受期電阻值≥3kΩ，非接受期電阻值<3kΩ的特點。而動情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值無相同的規(guī)律可尋。郭浩等[9]在文獻中提出電阻值的變化主要是由于在動情周期的不同階段，激素發(fā)生周期性變化，其作用于陰道，使黏液的分泌量及內容物發(fā)生了改變，從而陰道內的導電性發(fā)生改變，所以電阻值表現(xiàn)為從發(fā)情前期到發(fā)情期的不同變化狀態(tài)。而≥3kΩ的峰值出現(xiàn)的原因可能與黃體分泌的高峰期有關。而這些研究發(fā)現(xiàn)佐證了激素與大鼠動情周期的相關性。但并非所有雌性性成熟大鼠的動情周期都是規(guī)律變化的，很多大鼠的動情周期并不規(guī)律，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能為大鼠本身及外界因素的影響，比如一些氣味的影響以及過頻的電阻儀測量可能會作為一種刺激影響動物的發(fā)情。

卵巢切除術后大鼠陰道電阻值的波動特點顯示，兩組大鼠的陰道電阻值在進行卵巢切除術后均處于較低的水平。動情周期規(guī)律的大鼠其陰道電阻值失去其周期性變化處于較低的水平，其≥3kΩ的峰值也消失。Wistar雌性性成熟大鼠在切除卵巢后不能持續(xù)分泌性激素，大鼠的子宮內膜及陰道不能受到來自性激素的調控，其生理學變化消失，因此大鼠的陰道電阻值處于較低的水平且其周期性變化消失；卵巢切除后，卵泡及黃體的生理學變化消失，在此基礎上發(fā)生的激素分泌水平的變化隨之消失，由黃體分泌的孕酮即處于低水平狀態(tài)，這與大鼠的陰道電阻值失去其峰值有關[10]。動情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值不再無規(guī)律可循，同處于低水平。這也證實了卵巢切除后大鼠的動情周期排除了內源性激素的影響。

進行雌孕激素聯(lián)合給藥誘導后兩組大鼠連續(xù)兩個動情周期的陰道電阻圖均呈現(xiàn)規(guī)律且同步的變化。同時證明了此方法同樣適用于動情周期不規(guī)律的大鼠群體。即在對大鼠進行激素誘導之前已經(jīng)排除了其自身激素的影響。在注射苯甲酸雌二醇及雌二醇的第1、2天及未注射激素的第4天，大鼠的陰道電阻值水平<3kΩ，其與大鼠處于非接受期的特點一致；在注射孕酮的第3天，大鼠的陰道電阻值≥3kΩ，與大鼠處于接受期的特點一致。Marcondes等[11]研究報道雌二醇在大鼠的發(fā)情期開始升高，發(fā)情前達到峰值，發(fā)情時回到基線，孕酮分泌在動情間期和動情后期增加，隨后減少。此項研究發(fā)現(xiàn)在一定程度上證實了體外激素注射誘導動物動情周期的可靠性。苯甲酸雌二醇與雌二醇均為雌激素類藥物，但其代謝途徑及代謝產(chǎn)物不盡相同，另外3種激素在大鼠體內的代謝速率也會影響大鼠體內的激素水平從而表現(xiàn)為陰道電阻值的變化。

本實驗通過測量陰道電阻值的方法確定大鼠的動情周期并通過外源性雌孕激素注射的方法成功誘導大鼠規(guī)律的動情周期，為制備動情周期同步且規(guī)律的大鼠模型提供了新的方法。同時，筆者在前期的PMDD藥效實驗證實了在雌孕激素聯(lián)合給藥誘導大鼠人工動情周期的過程中如果進行其他的藥物試驗并不會對其產(chǎn)生影響。但關于如何對激素注射后的大鼠體內的內分泌代謝改變進行實時檢測以掌握激素在大鼠體內的詳細代謝機制等問題的解答仍需要開展進一步的實驗研究。