松果菊苷通過(guò)調(diào)控SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路改善肥胖糖尿病小鼠肝損傷

楊 洛 唐鳳娟 張 祥 廖 敏 郝亞榮

2型糖尿病(T2DM)作為嚴(yán)重威脅人類(lèi)身心健康的慢性代謝性疾病，會(huì)造成全身多器官損傷，其肝臟損傷以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)最常見(jiàn)。肝細(xì)胞中過(guò)多的脂質(zhì)積累，不僅會(huì)干擾代謝過(guò)程，還可能導(dǎo)致炎癥、肝纖維化，甚至肝癌[1]。由于這種疾病的發(fā)病機(jī)制在很大程度上仍然未知，因此盡管肝臟并發(fā)癥在T2DM患者中具有較高的發(fā)生率和重要的臨床意義，但在臨床實(shí)踐中通常會(huì)被忽視。目前普遍使用治療糖尿病的臨床藥物包括二甲雙胍、磺脲類(lèi)、TZDs、DPP-4抑制劑等，多會(huì)導(dǎo)致肝功能受損等不良反應(yīng)從而禁用于肝功能不全的患者。因此，新藥的開(kāi)發(fā)與研究具有非常重要的意義。松果菊苷是肉蓯蓉的主要成分，并且具有許多藥理性質(zhì)，例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調(diào)節(jié)活性[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)是脂類(lèi)和葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，它可以提高肝臟和其他組織的胰島素敏感度，并減輕肝臟脂肪變性[3]。db/db小鼠是一種自發(fā)性肥胖2型糖尿病小鼠，隨著周齡增加可出現(xiàn)貪食、肥胖，明顯的高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特征，其發(fā)病過(guò)程與2型糖尿病患者相似[4]。本研究擬采用db/db小鼠作為2型糖尿病肝損傷模型，予以松果菊苷(ECH)灌胃，觀察松果菊苷對(duì)糖尿病肝損傷的影響及其作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠(6周齡，20只)；同窩db/m小鼠(6周齡，9只)，均為雄性，購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究所，動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)：SCKK(蘇)2015-0001，飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房(SPF級(jí))，每籠4～5只，室溫22±2℃，相對(duì)濕度60%，每日12h光照/12h黑暗交替，期間自由攝食、飲水，常規(guī)普通飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)均符合武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定的要求。

2.主要儀器與試劑： One Touch Ulta血糖儀及血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司)；電子天平(Metter Toledo公司)；AU640全自動(dòng)生化儀(日本Olympus公司)；BX63型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；多功能酶標(biāo)儀DR-200Bs(美國(guó)Diatek公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)ABI公司)。松果菊苷(美國(guó)Sigma公司，純度94%)；4%多聚甲醛(谷歌生物科技有限公司)；蘇木精染液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；伊紅生物染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；油紅O染液(上海晶都生物技術(shù)有限公司)；兔抗人單克隆抗體SIRT1(貨號(hào)#9475)購(gòu)自美國(guó)CST公司，PGC-1α(貨號(hào)ab54481)、PPARα(貨號(hào)ab8934)、GAPDH(貨號(hào)ab37168)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，CPT1(貨號(hào)15184-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Thermo公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(谷歌生物科技有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

3.動(dòng)物分組與給藥：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，6周齡小鼠經(jīng)過(guò)檢疫1周及適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。編號(hào)并采用數(shù)字表法將db/db小鼠隨機(jī)分為兩組：1～10號(hào)為糖尿病模型組(db/db組，n=10),11～20號(hào)為松果菊苷治療組(db/db+ECH組，n=10)，db/m小鼠9只作為正常對(duì)照組(db/m組，n=9)，8周齡時(shí)分別給予如下干預(yù)：正常對(duì)照組和糖尿病模型組每天按照0.05ml/10g體質(zhì)量進(jìn)行0.9%氯化鈉注射液灌胃,松果菊苷治療組按松果菊苷300mg/(kg·d)灌胃。期間自由飲食飲水，持續(xù)10周。

4.一般情況與空腹血糖：實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的狀態(tài)、攝食、飲水和毛色光澤度等一般情況。各組從實(shí)驗(yàn)第1周(小鼠8周齡)開(kāi)始，每周檢測(cè)體質(zhì)量，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。

5.標(biāo)本采集：干預(yù)10周后，禁食不禁水處理12h，麻醉后眼眶采血，迅速分離血清，保存于-80℃冰箱用于生化指標(biāo)檢測(cè)。取血后處死小鼠，用生理鹽水心臟灌流，解剖取肝臟并稱(chēng)取質(zhì)量。肝質(zhì)量指數(shù)(liver index，LI)=[肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)]×100%。留取部分新鮮肝組織行病理切片，剩余肝臟組織置于液氮1h后保存在-80℃冰箱用于后續(xù)蛋白檢測(cè)和實(shí)時(shí)免疫熒光定量PCR。

6.肝臟病理組織學(xué)檢查：迅速分離新鮮肝組織，一部分用4%多聚甲醛固定24h后脫水石蠟包埋切片，二甲苯將切片脫蠟至水，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水后中性樹(shù)膠封片；另一部分組織OTC包埋后切片，50%乙醇稍洗后用油紅O工作液染色，50%乙醇分化,蒸餾水浸洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，流水返藍(lán)，風(fēng)干后封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理組織學(xué)改變。

7.血清、肝組織生化指標(biāo)檢測(cè)：血清標(biāo)本送至武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)，血脂指標(biāo)：甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

8. Western blot法檢測(cè)肝組織中SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白質(zhì)表達(dá)：取凍存的肝組織剪碎，取50mg，加入1ml RIPA 裂解液提取總蛋白，4℃13000r/min離心5min，收集上清液即為總蛋白溶液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。各組取40μg蛋白量上樣，轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜上，抗體孵育后行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值,GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

9.RT-PCR檢測(cè)肝組織中SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)：從-80℃冰箱取各組小鼠肝組織約100mg，按Trizol試劑盒提取總RNA，紫外吸收法進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green法配置反應(yīng)體系擴(kuò)增cDNA，每組樣本至少3個(gè)復(fù)孔，操作在冰上進(jìn)行。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)SIRT1、PGC-1α引物序列，由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，以管家基因β-actin為內(nèi)參照, β-actin上游引物序列為5 ′- CTATCCTTCTTCGCAT-3′，下游引物序列為 5′-TAATTGTCGCAGATCG-3′；SIRT1上游引物序列為5′-TCGTGGAGACATTTTTAATCAGG-3′，下游引物序列為5′-GCTTCATGATGGCAAGTGG-3′；PGC-1α上游引物序列為5′-CCCTGCCATTGTTAAGACC-3′，下游引物序列為5′-TGCTGCTGTTCCTGTTTTC-3′。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，65℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)溶解曲線分析來(lái)確定PCR擴(kuò)增特異性，讀取 Ct 值并采用2- △△Ct法計(jì)算目的基因 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.一般情況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正常對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好，毛色光滑，精神活躍；糖尿病模型組出現(xiàn)多飲多食現(xiàn)象，明顯肥胖，蜷伏不喜動(dòng)，毛發(fā)粗糙暗沉;松果菊苷治療組與糖尿病模型組比較，在各方面均有一定程度的好轉(zhuǎn)。

2.松果菊苷對(duì)糖尿病小鼠肝質(zhì)量指數(shù)和空腹血糖的影響：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第10周時(shí)，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組肝質(zhì)量指數(shù)和空腹血糖都顯著增加(P<0.01)，而松果菊苷治療組小鼠肝質(zhì)量指數(shù)較糖尿病模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血糖降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肝質(zhì)量指數(shù)及空腹血糖的比較

3.松果菊苷對(duì)糖尿病小鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變的影響：HE染色可見(jiàn)正常對(duì)照組肝細(xì)胞大小形態(tài)正常，肝小葉和肝竇結(jié)構(gòu)清晰；糖尿病模型組可見(jiàn)廣泛肝細(xì)胞變性氣球樣改變，肝細(xì)胞體積增大，胞核大小不均，病灶細(xì)胞壞死與匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；松果菊苷治療組明顯脂滴和炎性細(xì)胞減少，細(xì)胞壞死損傷減輕；油紅O染色鏡下觀察正常對(duì)照組肝臟組織細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)脂滴和病理改變；糖尿病模型組細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量大小不一的脂肪顆粒。與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組脂滴染色明顯減少。

圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色(×200)

4.松果菊苷對(duì)糖尿病小鼠肝功能和脂質(zhì)代謝的影響：肝功能與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組小鼠ALT明顯升高(P<0.01)，同樣AST也升高(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組ALT降低(P<0.05)，AST也明顯降低(P<0.01)；血脂水平與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組TC、TG、LDL-C顯著升高(P<0.01)，HDL-C顯著降低(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組TC、TG、LDL-C降低, HDL-C升高(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病模型組比較，#P<0.05

5.松果菊苷對(duì)糖尿病小鼠肝臟SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組小鼠肝臟組織SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1α蛋白質(zhì)水平明顯降低(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組蛋白質(zhì)水平明顯升高(P<0.01)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白表達(dá)量和相對(duì)灰度比與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與糖尿病模型組比較， #P<0.01

6.松果菊苷對(duì)糖尿病小鼠肝臟SIRT1、PGC-1α mRNA 表達(dá)的影響：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組SIRT1、PGC-1α明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，經(jīng)松果菊苷干預(yù)后，SIRT1明顯增加(P<0.01)以及PGC-1α明顯增加(P<0.05)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組SIRT1、PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與糖尿病模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

糖尿病是全球主要的醫(yī)學(xué)問(wèn)題之一，到2035年全球糖尿病發(fā)生預(yù)計(jì)將達(dá)到5.92億。我國(guó)糖尿病發(fā)生率呈明顯增加趨勢(shì)，其中大部分為2型糖尿病。2型糖尿病與肝病變有著復(fù)雜的牽連,其引起的肝損傷以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)最為常見(jiàn)。NAFLD現(xiàn)已被公認(rèn)為全球最常見(jiàn)的慢性肝病，是一種以肝臟脂肪沉積過(guò)多為特征的病理狀態(tài)[5]。NAFLD與胰島素抵抗和血脂異常密切相關(guān)，在2型糖尿病和(或)肥胖者中高度流行。許多代謝因素已被證明與NAFLD的發(fā)展有關(guān)，盡管如此，這種疾病的發(fā)病機(jī)制仍然很大程度上未知[1]。管花肉蓯蓉是一種多年生寄生植物，生長(zhǎng)于固沙植物的根部，根據(jù)《中國(guó)藥典》，肉蓯蓉通常被用作治療腎臟疾病和不孕不育[6]。

近年來(lái)有研究證實(shí)管花肉蓯蓉能夠顯著抑制db/db小鼠空腹和餐后血糖水平升高，改善胰島素抵抗和血脂異常，減輕體質(zhì)量[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖和糖尿病會(huì)引起小鼠肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT、AST水平顯著升高和典型組織病理學(xué)改變。松果菊苷可顯著降低小鼠的肝質(zhì)量指數(shù)和血糖，同時(shí)降低TC、TG、LDL-C的水平并且提高HDL-C水平，組織病理檢查上顯示松果菊苷能夠減輕肝細(xì)胞脂肪樣變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)松果菊苷能夠改善肥胖糖尿病小鼠肝損傷。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1 (silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)，是一種NAD依賴(lài)性脫乙酰酶，最近已被證明與NAFLD的病理生理有關(guān)[8]。SIRT1參與各種細(xì)胞生理過(guò)程，例如脂質(zhì)和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)以及胰島素敏感度，是代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該酶在肝臟中高度表達(dá)，抑制SIRT1會(huì)上調(diào)糖異生和脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)水平的升高[9]。肥胖患者，尤其是胰島素抵抗、糖尿病和NAFLD患者的SIRT1水平較低[10]。Price等[11]已經(jīng)介紹了SIRT1在預(yù)防肝臟脂肪變性中的作用，并且發(fā)現(xiàn)NAFLD患者中的SIRT1表達(dá)水平降低。有研究表明，肝細(xì)胞特異性敲除SIRT1可減少脂肪酸氧化，誘導(dǎo)了肝臟中脂肪變性和炎癥；而過(guò)表達(dá)SIRT1可通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善脂質(zhì)代謝[12]。PGC-1α活性受SIRT1調(diào)節(jié)，并且二者都是維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[13]。因此，SIRT1/PGC-1α可能是肝損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PGC共激活因子是一種可以與轉(zhuǎn)錄因子或核受體相結(jié)合增加轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子均需要輔助激活因子，特別是核受體PPAR，過(guò)氧化物增殖物激活受體α(PPARα)主要存在于肝臟、心肌和骨骼肌等氧化組織中，它可激活促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化、酮生成和糖異生的基因轉(zhuǎn)錄[14]。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1 (CPT1)是脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)受復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子(TF)和輔助激活因子，包括SIRT1、PGC-1α、PPARα等。

本研究在糖尿病模型組高血糖濃度下，伴隨著SIRT1的表達(dá)下調(diào)，肝細(xì)胞中脂質(zhì)積累增加；在松果菊苷治療組中SIRT1、PGC-1α蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)顯著增加，下游因子PPARα、CPT1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加，這表明SIRT1 / PGC-1α信號(hào)軸及其下游因子參與了糖尿病肝損傷后治療的有益作用。綜上所述，松果菊苷通過(guò)調(diào)控SIRT1/PGC-1α及其下游因子的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)血糖和脂質(zhì)代謝，從而改善糖尿病肝損傷。