多指標(biāo)綜合評分法正交實驗優(yōu)選菊花的炒制工藝*

張姍姍 ，姚夢雪 ，范蘭蘭 ，江 瑜 ，蘇 敏 ，汪小莉 ，洪 燕 ，韓燕全 ，吳德玲

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230031）

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序，其味苦、甘，性微寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目、解毒消腫的功效[1]。菊花主要含有黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類等活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明菊花具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等多種作用，目前臨床多用于風(fēng)熱感冒、眩暈、目赤昏花等病癥的治療[2-4]。

炒菊花最先出現(xiàn)在宋代《類編朱氏集驗醫(yī)方》[5]，后在明清時期發(fā)展成炒黑《藥籠小品》[6]和煨炭《本草害利》[7]。清代《本草便讀》[8]記載生菊花味甘性寒，善于平息肝風(fēng)和肝火。脾胃虛寒，食少泄瀉之病，應(yīng)該少用（《本草匯言》）[9]?！秾嵱弥兴幣谥茖W(xué)》中指出菊花采用文火炒至微黃色，可以降低其寒性[10]。清代《外科大成》[11]記載“燒炭存性”，菊花炒炭后具有制寒止血的功效，而疏散風(fēng)熱等作用減弱（《新編中藥志》）[12]。歷版《中華人民共和國藥典》（簡稱“中國藥典”）均未收錄炒菊花，而上海市2008年版《中藥飲片炮制規(guī)范》和浙江省1986年版《中藥飲片炮制規(guī)范》等[13-16]炮制規(guī)范收錄了炒菊花，其炮制程度類似，以炒至表面微具焦斑或呈焦黑色為準(zhǔn)。在菊花實際炒制過程中，具體的炮制工藝參數(shù)不清楚，炮制終點主要靠個人經(jīng)驗判斷，導(dǎo)致炒菊花的質(zhì)量參差不齊，進而影響其臨床療效。本實驗采用多指標(biāo)綜合評分法正交實驗，同時測定綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、芹菜素、總黃酮含量，并以這6種成分和總黃酮含量為考察指標(biāo)，對菊花炒制工藝進行優(yōu)化，以期為菊花炒制工藝的建立提供參考。

1 儀器及試劑與藥品

1.1 儀器 Aglient-8453型紫外分光光度計（濟南賽場科學(xué)儀器有限公司），KDC-16H型離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），BZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司），BP211D型電子天平（德國Sartorius公司），KQ3200D型超聲波清洗儀（江蘇省昆山超聲儀器有限公司），Waters Acquity型超高效液相色譜（UPLC）柱（美國Waters公司），AS-D400A紅外線測溫儀（武漢中測宏圖測量儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品 綠原酸（批號：327-97-9），木犀草苷（批號：5373-11-5），3，4-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ枺?2041114），3，5-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ枺?450-53-5），木犀草素（批號：491-70-3），芹菜素（批號：520-36-5），蘆?。ㄅ枺?00080-200707），對照品均購買自成都曼思特生物科技有限公司，甲醇和乙腈均是色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，其他實驗試劑均為分析純。菊花購自亳州市佰世信中藥飲片有限公司，批號：170803，經(jīng)文章通訊作者韓燕全主任中藥師鑒定為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序。采用UPLC法對菊花中綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡?；鼘幩岷窟M行測定，結(jié)果均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒菊花的制備 稱取干凈的菊花15 g，放入炒制容器內(nèi)，按照2015年版《中國藥典》（四部）炮制通則“0213”項下清炒法炮制，采用文火炒制，炒至菊花顏色呈現(xiàn)深黃色時取出，放置攤涼，篩去多余的碎屑，放于粉碎機中粉碎，留存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱溫30℃，流速0.2mL/min，進樣量為 1 μL，以乙腈（A）-0.1%的磷酸（C）為流動相，檢測波長為 348 nm，梯度洗脫（0-4 min，18%～20%A；4-9 min，20%A；9-11 min，20%～25%A；11-13 min，25%～35%A；13-18 min，35%～10%A；18-20 min，10%～18%A；20-22 min，18%A）。在該色譜條件下，炒菊花與混合對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品與炒菊花的UPLC圖

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩?、3，5-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、芹菜素對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，制成濃度分別為51 μg/mL綠原酸、25 μg/mL木犀草苷、8.3 μg/mL 3，4-二咖啡?；鼘幩?、129 μg/mL 3，5-二咖啡?；鼘幩帷?.2 μg/mL 木犀草素、35 μg/mL芹菜素的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取菊花粉末（過1號篩）0.25 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，再精確量取70%甲醇25 mL，加入錐形瓶中，密封塞緊，稱取重量，在功率為300 W，頻率為45 kHz條件下超聲提取40 min，放冷后，稱取重量，采用濃度為70%甲醇補足減失的重量，混勻后，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，根據(jù)上述色譜條件進樣，以綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩帷?，5-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、芹菜素各對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 6種成分的線性回歸方程

2.2.5 精密度實驗 精密吸取上述混合對照品溶液1 μL，按照上述色譜條件進樣，重復(fù)進樣6次，記錄6種成分的峰面積，計算得到綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩?、3，5-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素、芹菜素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值在0.12%～0.41%之間，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 分別精密吸取同一份炒菊花供試品溶液，分別在 0、4、8、12、16、24 h 進樣，按照上述色譜條件測定，計算得到綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩?、3，5-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD值在0.20%～1.06%之間，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性實驗 取同一份炮制品炒菊花分為6份，按照上述條件制備6份供試品溶液。按照上述色譜條件進樣測定，計算得到綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩帷?，5-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素和芹菜素6種指標(biāo)成分含量的RSD值在0.19%～1.01%之間，說明供試品樣品處理方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實驗 準(zhǔn)備已明確其含量的6份炒菊花，根據(jù)上述條件制備6份供試品溶液，每份供試品精確吸取0.5 mL，在每份供試品中加入與樣品中成分含量接近的對照品，混勻后，選擇0.2 μm微孔濾膜過濾，根據(jù)上述色譜條件進樣測定，計算得到綠原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡?；鼘幩帷?，5-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素和芹菜素的平均加樣回收率在96.88%～110.3%之間，RSD在0.00%～0.48%之間，說明該方法準(zhǔn)確良好。

2.3 總黃酮含量測定 精密稱取蘆丁對照品5 mg，放于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，即制備成濃度為200 μg/mL的蘆丁對照品溶液，放置于冰箱保存，待用。

用移液管精確量取蘆丁對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，各自放于25 mL容量瓶里，加蒸餾水6 mL，加5%亞硝酸鈉（NaNO2）溶液1.0mL，搖勻放置6min，加 10%硝酸鋁[Al（NO3）3]溶液 1.0 mL，搖勻放置6 min，加 4%氫氧化鈉（NaOH）溶液 10 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min。以第1管為空白對照，在510nm波長處用紫外分光光度計測定A值[17]。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（X），A值為縱坐標(biāo)（Y^），得到線性回歸方程為Y^=16.03X-0.015 4，r=0.999 2。

精密量取樣品溶液2 mL，按照上述方法進行操作，把波長設(shè)置成510 nm，依次用紫外分光光度計測定各個樣品的A值，每個樣品均需測3次，把樣品的A值代入線性回歸方程中，計算得到樣品中總黃酮的含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用綜合加權(quán)評分法評估菊花炒制工藝，根據(jù)其藥理作用及藥效方面的藥用價值，將總黃酮的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4，其他6個成分的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.1。綜合評分=（總黃酮含量/總黃酮最大含量）×100×0.4+（綠原酸含量/綠原酸最大含量）×100×0.1+（木犀草苷含量/木犀草苷最大含量）×100×0.1+（3，4-二咖啡?；鼘幩岷?3，4-二咖啡?；鼘幩嶙畲蠛浚?00×0.1+（3，5-二咖啡?；鼘幩岷?3，5二咖啡?；鼘幩嶙畲蠛浚?00×0.1+（木犀草素含量/木犀草素最大含量）×100×0.1+（芹菜素含量/芹菜素最大含量）×100×0.1，優(yōu)化菊花炒制工藝。

2.5 單因素實驗

2.5.1 炒制溫度考察 稱取干凈的菊花飲片7份，每份15 g。將菊花放入炒制容器內(nèi)，炒制溫度分別設(shè)置成 90、110、130、150、170、190、210 ℃，炒制時間為5 min。根據(jù)上述條件制備供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件進樣，計算各個樣品中總黃酮和上述6個成分含量，并進行綜合評分，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示在炒制溫度為130℃時，炒菊花的綜合評分最高。

2.5.2 炒制時間考察 依據(jù)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)臨方炮制炒菊花，以炒至深黃色為準(zhǔn)，及2015年版《中國藥典》（四部）炮制通則“0213”項下清炒法炒至微黃色或深黃色規(guī)定，把炒制時間設(shè)置為 6 個水平（5、6、7、8、9、10 min）。分別稱取干凈的菊花飲片6份，每份15 g。將菊花放入炒制容器內(nèi)，分別炒制 5、6、7、8、9、10 min。根據(jù)上述條件制備供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件進樣，計算各個樣品中總黃酮和上述6個成分的含量，并進行綜合評分，結(jié)果見表3。結(jié)果表明當(dāng)炒制時間為8 min時，綜合評分最高。

表2 炒制溫度考察結(jié)果

表3 炒制時間考察的結(jié)果

2.6 正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以炒制溫度和炒制時間為考察因素，每個因素選擇3個水平，以菊花6種成分和總黃酮含量為綜合評分指標(biāo)。采用多指標(biāo)正交實驗法，優(yōu)化菊花炒制工藝[18-20]，因素水平見表4。

表4 因素水平表

2.7 正交實驗結(jié)果按照L9（34）正交表進行正交實驗，按照上述條件制備供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件進樣，計算6種成分的含量。按照“2.3”項下方法計算總黃酮的含量。采用綜合加權(quán)評分法，優(yōu)化菊花炒制工藝，結(jié)果見表5及表6。

表5和表6結(jié)果顯示，各因素對實驗影響程度為炒制溫度＞炒制時間，在6～10 min炒制時間范圍內(nèi)，炒制時間對實驗結(jié)果無顯著影響，而炒制溫度對實驗結(jié)果有顯著影響，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。正交實驗的結(jié)果表明菊花的最佳炒制工藝為炒制溫度130℃，炒制時間8 min。

2.8 驗證實驗 根據(jù)優(yōu)選出的菊花炒制工藝制備3組炒菊花，對每組樣品6種成分和總黃酮含量進行測定，得到3組驗證實驗的綜合評分值，其綜合評分值的RSD值為0.2%，說明此炒制方法穩(wěn)定可行，結(jié)果如表7所示。

3 討論與結(jié)論

實驗考察了色譜柱、波長、柱溫、進樣量、流速和流動相等對色譜峰分離度的影響，最終確定色譜柱為WatersAcquityBEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm），波長為348 nm，柱溫為30℃，進樣量為1 μL，流速為0.2 mL/min，流動相為0.1%磷酸-乙腈。在此條件下各色譜峰基線平穩(wěn)，分離度良好。本實驗選擇的檢測方法可靠穩(wěn)定。

表5 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表6 方差分析表

炒菊花是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色臨方炮制品種之一，其炒制工藝及炒制相關(guān)參數(shù)未見報道。炒制溫度和炒制時間等炮制因素可能對飲片的質(zhì)量產(chǎn)生影響。本實驗通過單因素實驗，確定炒制溫度和炒制時間為影響菊花質(zhì)量的主要因素。黃酮類和有機酸類等成分是菊花的主要活性成分，在菊花中含量較高。文獻報道，黃酮類成分中木犀草素、芹菜素和木犀草苷具有抗氧化、清除自由基和修復(fù)肝細胞損傷等藥理作用。有機酸類成分中3，4-二咖啡?；鼘幩岷?，5-二咖啡?；鼘幩峋哂星宄趸镪庪x子自由基和抗氧化作用[21]。而且2015年版《中國藥典》將綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡酰基奎寧酸作為菊花的主要活性成分。因此，本課題選擇炒制溫度和炒制時間為考察因素，選擇綠原酸、3，4-二咖啡?；鼘幩帷?，5-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、總黃酮含量為考察指標(biāo)，最終優(yōu)選出菊花炒制工藝為炒制溫度130℃，炒制時間8 min。同時對工藝進行驗證，得到3組驗證實驗的綜合評分值，其綜合評分值的RSD值為0.2%，說明此炒制方法穩(wěn)定可行。

表7 最佳工藝結(jié)果分析