同時(shí)檢測(cè)豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素UPLC-MS/MS方法的建立

王宏磊，劉義明，徐 飛，陳孝杰，張志博，華偉毅，蔣玲玉，李秀波

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100081)

動(dòng)物寄生蟲病是危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一種重大疾病，能夠使患病動(dòng)物表現(xiàn)為生產(chǎn)緩慢、抵抗力低下，嚴(yán)重時(shí)致動(dòng)物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的動(dòng)物抗寄生蟲藥毒性大、殘留高、效力低，在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的使用過程中受到了一定的限制[1-2]。芬苯達(dá)唑是人工合成的芳香雜環(huán)化合物，屬于苯并咪唑類藥物。奧吩達(dá)唑和芬苯達(dá)唑砜是芬苯達(dá)唑在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝物[3]。芬苯達(dá)唑的化學(xué)名稱為苯硫咪胺甲酯，為白色或類白色粉末，無(wú)臭，無(wú)味，能溶解于冰醋酸、二甲基亞砜，微溶于甲醇，不溶于水[4]。其驅(qū)蟲譜廣泛、毒性小、安全范圍大，是國(guó)內(nèi)首選的動(dòng)物驅(qū)蟲藥[5]。伊維菌素是阿維菌素類藥物的一種，由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素驅(qū)蟲藥[6]，為白色結(jié)晶粉末、無(wú)味，能溶于甲醇、乙腈、丙酮，幾乎不溶于水，微有引濕性。其作用機(jī)理是干擾寄生蟲的神經(jīng)活動(dòng)，導(dǎo)致寄生蟲出現(xiàn)麻痹死亡[7-8]，抗蟲譜廣、高效、安全[9-10]。芬苯達(dá)唑和伊維菌素主要用于豬、馬、牛、羊、犬、貓、野生動(dòng)物等的驅(qū)蟲。二者聯(lián)合用藥，擴(kuò)大了驅(qū)蟲譜，提高了一次性驅(qū)蟲效果，減輕了人們多次給藥的麻煩，也減輕了多次給藥對(duì)動(dòng)物機(jī)體的應(yīng)激刺激，并且兩者不同的殺蟲機(jī)制使其具有協(xié)同作用，降低耐藥蟲株的產(chǎn)生。目前沒有同時(shí)測(cè)定血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素的方法，本文建立了同時(shí)測(cè)定豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，回收率高，定量限低，抗干擾能力強(qiáng)，適用于血漿中這4種藥物的同時(shí)檢測(cè)，為血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素的藥物代動(dòng)力學(xué)研究提供檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC，美國(guó) WATERS公司)，質(zhì)譜儀 (Xevo TQ-S Mass Detector 美國(guó) WATERS公司)，CPA4202S電子天平(德國(guó) Sartorius公司)，N-EVAP112氮?dú)鉂饪s儀(美國(guó) Organomation公司)，Biofuge stratos低溫離心機(jī)(美國(guó) Thermo Fishers公司)，Reference移液槍(美國(guó) Eppendorf公司)，KQ-30B0DE數(shù)控超聲波清洗器(中國(guó) 舒美公司)，N-EVAP-24超純水系統(tǒng)(德國(guó) Membrapure公司)，G560E渦動(dòng)議(美國(guó) Scientific industry公司)。

1.2 試劑 芬苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0441108，含量：100.0%)，奧芬達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)：112511，含量：98.0%)，芬苯達(dá)唑砜標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大多倫多研究化學(xué)公司，批號(hào)：#1-EQJ-10-1，含量：100%)，伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0191406，含量：91.0%)。甲醇、乙腈、甲酸銨為質(zhì)譜純，均購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。固相萃取小柱：Bond Elut C18 500 mg/6 mL，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。0.22 μm針筒式微孔濾膜，購(gòu)自美國(guó)WATERS公司。2 mL醫(yī)用注射器，購(gòu)自中國(guó)康壽公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相A：5 mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 mL。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition (%)

1.3.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，電噴霧毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3.2 KV、30 V霧化溫度為800 ℃，去溶劑氣流速和錐孔反吹氣流量分別為500 L/Hr、150 L/Hr，二級(jí)碰撞氣為氬氣，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的母離子、子離子參數(shù)如表2所示。

表2 芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin

1.3.2 儲(chǔ)備液的配制 芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素儲(chǔ)備液的配置：分別精密稱取芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品50.00 mg、51.02 mg、50.00 mg、54.95 mg，然后加入到50 mL的容量瓶中。先向裝有芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜的50 mL的容量瓶中加入10 mL的冰醋酸，然后渦旋1 min、超聲10 min，使其完全溶解，最后加入甲醇定容至50 mL。向裝有伊維菌素的容量瓶中直接加入甲醇定容至50 mL，然后渦旋1 min、超聲10 min。得到濃度為1 000 μg/L的4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液放置在-20 ℃的冰箱中備用。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 樣品提取 取1 mL血漿于10 mL的離心管中，加入2 mL乙腈，渦動(dòng)1 min，在5 000 r/min、 10 ℃的條件下離心10 min，將提取液轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中。再向殘?jiān)屑尤? mL的乙腈，按照上述條件進(jìn)行2次離心，將提取液與第1次的合并，然后向合并的提取液中加入30 mL的水。

1.3.3.2 樣品的凈化 將SPE小柱固定在固相萃取真空裝置上，用5 mL的乙腈活化小柱，5 mL乙腈-水-三乙胺(V∶V∶V=40∶60∶0.1)平衡小柱，將上一步得到的提取液全部過柱。在提取液過柱的過程中，調(diào)節(jié)真空泵的壓力，使液體1滴/s勻速流下。最后用5 mL的甲醇-乙腈(V∶V=1∶1)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于10 mL的離心管中。在40 ℃水域下用氮?dú)獯蹈伞Ｓ? mL 0.1%甲酸甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm針筒式微孔濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 檢測(cè)限和定量限 用處理過的空白血漿提取液作為稀釋液，配置一系列不同濃度的芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素混合基質(zhì)添加液，過0.22 μm針筒式微孔濾膜，然后上機(jī)檢測(cè)。以信噪比S/N≥3的最小濃度作為檢測(cè)限，以信噪比S/N≥10的最小濃度作為定量限。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度：將一定濃度的芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白血漿中，配成高、中、低3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度5個(gè)平行，計(jì)算回收率，衡量準(zhǔn)確度。精密度：將一定濃度的芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白血漿中，配成高、中、低3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度5個(gè)平行，1 d內(nèi)每個(gè)濃度測(cè)定5個(gè)樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5 d的試驗(yàn)。

1.3.6 工作曲線 用處理過的空白血漿提取液將芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度為100 μg/L、75 μg/L、50 μg/L、25 μg/L、10 μg/L和1 μg/L的樣品液。用已建立的檢測(cè)方法測(cè)定芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的峰面積，以芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸分析。

1.4 動(dòng)物給藥及采血 選擇(20±2) kg的健康豬2頭，按7.5 mg/(kg·bw)的劑量經(jīng)胃管一次性給予復(fù)方芬苯達(dá)唑伊維菌素粉劑(規(guī)格：100 g含有芬苯達(dá)唑12 g、伊維菌素0.6 g，用法用量以芬苯達(dá)唑計(jì))，藥物用水沖服，再以適量的水沖洗胃管。在給藥后的1 h從豬的前腔靜脈采血10 mL，血樣采集后放入預(yù)先用肝素鈉處理過的離心管，在3 000 r/min離心10 min后吸取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血漿樣品檢測(cè) 按照1.3.3 樣品前處理方法處理采集的血漿樣品，按照1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行血漿樣品的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)限和定量限 按照信噪比S/N≥3的最小濃度作為檢測(cè)限，信噪比S/N≥10的最小濃度作為定量限的要求，得出芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的檢測(cè)限分別為0.05 μg/L、0.05 μg/L、0.05 μg/L和0.01 μg/L，定量限分別為0.1 μg/L、0.1 μg/L、0.1 μg/L和0.2 μg/L。定量限的色譜圖見中插彩版圖1～4。

圖1 血漿中芬苯達(dá)唑的定量限Fig.1 Quantitative limit of fenbendazole in plasma

圖2 血漿中奧芬達(dá)唑的定量限Fig.2 Quantitative limit of oxfendazole in plasma

圖3 血漿中芬苯達(dá)唑砜的定量限Fig.3 Quantitative limit of fenbendazole sulfone in plasma

圖4 血漿中伊維菌素的定量限Fig.4 Quantitative limit of lvermectin in plasma

2.2 準(zhǔn)確度和精密度 方法的準(zhǔn)確度是指試驗(yàn)中的測(cè)定值與準(zhǔn)確值的接近程度，一般在樣品檢測(cè)時(shí)用樣品的添加回收率來體現(xiàn)方法的準(zhǔn)確度。精密度表示方法的重復(fù)性，是指同一樣品的測(cè)定結(jié)果與平均值的偏離程度。方法的精密度通常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，也稱變異系數(shù)，用RSD表示，能夠反映隨機(jī)誤差的大小。芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素在3個(gè)不同濃度的回收率范圍分別為89.42%～94.33%、79.05%～92.28%、86.19%～92.29%、82.09%～88.40%。批內(nèi)變異系數(shù)的范圍分別為1.71%～7.11%、1.80%～12.99%、2.37%～17.90%、3.74%～13.70%。批間變異系數(shù)的范圍分別為4.43%～6.27%、5.05%～10.44%、5.73%～8.84%、5.74%～9.97%。如表3。

表3 血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的回收率及批間、批內(nèi)變異系數(shù)Table 3 Recovery rate,inter and intra batch variation coefficient of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma

2.3 線性范圍 以色譜圖上的藥物峰面積為縱坐標(biāo)y，以藥物的添加濃度為橫坐標(biāo)x，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析后，得到的芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù),如表4。

表4 血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)rTable 4 Regression equation and correlation coefficient r of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma

2.4 血漿樣品檢測(cè) 給藥后1 h的2頭試驗(yàn)豬血漿的檢測(cè)結(jié)果如下：1號(hào)豬芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素的濃度分別為28.8 μg/L、37.3 μg/L、1.28 μg/L和4.04 μg/L；2號(hào)豬4種藥物的濃度分別為22.7 μg/L、29.9 μg/L、1.2 μg/L和3.9 μg/L。血漿色譜圖如圖5～8。

圖5 1號(hào)豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的總離子流圖Fig.5 Total ion flow diagram of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma of number 1 pig

圖6 1號(hào)豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的色譜圖Fig.6 Chromatogram of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma of number 1 pig

圖7 2號(hào)豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma of number 2 pig

圖8 2號(hào)豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的色譜圖Fig.8 Chromatogram of fenbendazole,oxfendazole,fenbendazole sulfone and ivermectin in plasma of number 2 pig

3 討論

3.2 提取劑的選擇 選擇合適的提取液來提取血漿或牛奶中的伊維菌素和芬苯達(dá)唑已經(jīng)有大量的研究和報(bào)道。乙腈對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的溶解性較小，且可以沉淀血漿中的蛋白質(zhì)，還可以與血漿中的水以任意比例混溶[13]。周鑫等[8]比較了用丙酮、二氯甲烷、乙腈和乙酸乙酯作為提取液提取牛奶中的伊維菌素，得出乙腈是理想的提取劑。邢麗紅等[14]比較了乙腈、甲醇和乙酸乙酯作為提取液提取鱸魚組織中的伊維菌素的提取效率，結(jié)果表明，乙腈的回收率高、乙酸乙酯和甲醇的回收率低。范盛先等[13]用乙腈提取豬牛羊可食性組織的阿苯達(dá)唑類藥物，得到的回收率都在75%以上。Fletouris D J等[15]用乙腈提取牛奶中的芬苯達(dá)唑，回收率接近100%。劉洪斌[16]用含5%乙酸的乙腈提取牛奶中12種苯并咪唑類藥物，平均回收率在70%以上。所以本試驗(yàn)也選擇了提取能力強(qiáng)的乙腈作為提取液。結(jié)果表明，4種藥物的峰形好、雜質(zhì)峰較少、基質(zhì)干擾程度低。

3.3 固相萃取小柱的選擇 楊君宏等[17]和王亮[18]用堿性氧化鋁固相萃取小柱凈化牛肉組織中的伊維菌素，回收率在70%以上。本試驗(yàn)開始選用的是堿性氧化鋁固相萃取小柱，但是凈化的效果不佳，芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的回收率都只有50%左右。對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行改進(jìn)，參照王梅等[19]、岳虹等[20]和Moreno L等[21]采用C18固相萃取小柱凈化伊維菌素和芬苯達(dá)唑的方法，本試驗(yàn)中4種藥物的回收率都達(dá)到了70%以上，并且藥物峰與雜質(zhì)峰能夠分開。對(duì)凈化方法進(jìn)一步優(yōu)化，參考周德剛等[22]對(duì)兔排泄物中的伊維菌素的提取方法，在過柱之前向乙腈提取出的溶液中加入30 mL的水，將提取液稀釋成10%的乙腈溶液，然后再過固相萃取小柱，4種藥物的回收率可以達(dá)到80%以上。

3.4 色譜柱的選擇 李晶[23]對(duì)C8和C18色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較，C8柱比C18柱的出峰時(shí)間短，導(dǎo)致芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜難以和雜質(zhì)干擾峰分離完全，故其選用了C18色譜柱。丁艷[24]測(cè)定復(fù)方芬苯達(dá)唑片中芬苯達(dá)唑和吡喹酮的含量和吳海港[4]測(cè)定豬血漿中的芬苯達(dá)唑選用的都是C18色譜柱，得到的芬苯達(dá)唑的色譜圖峰形好。故本試驗(yàn)也選用了C18色譜柱，能夠得到峰形好、出峰時(shí)間早的4種藥物的色譜圖。

3.5 檢測(cè)限和定量限 郜進(jìn)[5]測(cè)定狗血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜的檢測(cè)限為2 μg/L、定量限為5 μg/L，本試驗(yàn)得到的豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜的檢測(cè)限為0.05 μg/L、定量限為0.1 μg/L，檢測(cè)限和定量限都更低。

3.6 回收率及標(biāo)準(zhǔn)曲線 本試驗(yàn)得到的芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素的回收率都在80%以上，回收率比較高。4種藥物的線性方程都比較好，其相關(guān)系數(shù)r都在0.999 2以上，說明線性方程的擬合度高，滿足工作曲線的要求，可以用于血漿樣品中4種藥物的含量測(cè)定。

3.7 血漿樣品檢測(cè) 在2個(gè)試驗(yàn)豬的血漿中均檢測(cè)到了芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、伊維菌素。1號(hào)豬血漿中4種藥物的濃度分別為23.9 μg/L、207.3 μg/L、32.3 μg/L、15.2 μg/L；2號(hào)豬血漿中4種藥物的濃度分別為28.3 μg/L、236 μg/L、42 μg/L、12.0 μg/L。說明本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法，能夠用于豬血漿中這4種藥物的同時(shí)檢測(cè)。

4 結(jié)論

本文建立了豬血漿中芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜和伊維菌素的UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)方法。該方法測(cè)得的血漿中4種藥物的定量限分別為0.1 μg/L、0.1 μg/L、0.1 μg/L和0.2 μg/L，靈敏度高；4種藥物的回收率都能在80%以上，回收率高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r都在0.999 2以上，滿足試驗(yàn)要求。在2只試驗(yàn)豬的血漿中檢測(cè)到了4種藥物，說明該方法可為4種藥物在豬血漿中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供檢測(cè)方法。