3種常用消毒劑對基因VII型新城疫病毒的滅活效果

劉 梅，沈欣悅，李建梅，俞 燕，戴亞斌

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

消毒是動(dòng)物疫病綜合防控中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是撲滅疫病最有效的措施，其目的是消滅環(huán)境中的病原體，切斷傳播途徑，阻止疫病傳播蔓延。疫苗免疫接種和藥物防治方法只能針對特定的疫病，而消毒可以針對所有疫病。在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，建立健全消毒制度，科學(xué)合理地選用消毒劑對飲水、禽舍及其環(huán)境進(jìn)行消毒，可有效降低疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)強(qiáng)毒株感染引起的禽類的一種急性、高度接觸性烈性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為須申報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病，且在2012年發(fā)布的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中列為優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病。當(dāng)前我國NDV的優(yōu)勢流行株為基因VII型強(qiáng)毒株，免疫接種與消毒、隔離等措施相結(jié)合可有效防控該病發(fā)生。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，癸甲溴銨溶液、聚維酮碘溶液和戊二醛苯扎溴銨溶液為目前種雞場常用消毒劑。雖然已有研究者對它們的消毒效果進(jìn)行了評價(jià)[2-8]，然而，除高富紅等[8]觀察了戊二醛苯扎溴銨溶液對NDV LaSota株的滅活效果外，至今尚未有它們對基因VII型NDV滅活效果的報(bào)道。為此，本研究對上述3種消毒劑滅活基因VII型NDV的效果進(jìn)行了評價(jià)，明確了它們的毒性作用、最低有效濃度和工作液的保存期，旨在為種禽場ND防控中的消毒劑選擇和使用以及合理的消毒措施制定提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 毒株和雞胚 基因VII型NDV毒株JSC0804分離自發(fā)病雞群，本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存[9]。SPF種蛋，購自浙江恒達(dá)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，自行孵化至10日齡。

1.2 消毒劑 癸甲溴銨溶液[獸藥字(2014)150343067]、聚維酮碘溶液[獸藥字(2012)100011577]和戊二醛苯扎溴銨溶液[獸藥字(2014)160032459]3種消毒劑均由江蘇某大型主要疫病凈化示范種雞場提供。產(chǎn)品信息見表1。試驗(yàn)時(shí)消毒劑均在有效期內(nèi)。

表1 本研究用的消毒劑信息Table 1 Information of disinfectants used in this study

1.3 病毒液制備 基因VII型NDV JSC0804株種毒用10日齡SPF雞胚連續(xù)傳代2次復(fù)壯。收集第2代死亡雞胚尿囊液測定病毒雞胚半數(shù)致死量(ELD50)[10]。測得的病毒ELD50為10-8.32/0.1 mL。據(jù)此，本研究采用103倍稀釋的病毒尿囊液作為病毒工作液。

1.4 中和劑 癸甲溴銨溶液用中和劑為含30 mL/L吐溫80、3 g/L卵磷脂和10 g/L甘氨酸的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.2)；聚維酮碘溶液用中和劑為含5 g/L硫代硫酸鈉、10 mL/L吐溫80和2 g/L卵磷脂的PBS；戊二醛苯扎溴銨溶液用中和劑為含40 mL/L吐溫80和5 g/L甘氨酸的PBS。配制的中和劑高壓滅菌后備用。

1.5 消毒劑對雞胚最大安全劑量測定 先用PBS將消毒劑5倍稀釋，然后再依次倍比稀釋(見表2)。每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡雞胚，0.1 mL/胚。雞胚接種后置37 ℃繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察144 h，同時(shí)設(shè)PBS對照組。試驗(yàn)重復(fù)3次。依下列公式計(jì)算不同稀釋度消毒劑接種后的雞胚死亡率。

雞胚死亡率(%)=死亡雞胚數(shù)/接種雞胚數(shù)×100%

1.6 消毒劑與中和劑的中和產(chǎn)物對雞胚的毒性測定 將消毒劑和中和劑按1∶9比例混合均勻后，作用10 min。然后將中和產(chǎn)物用PBS依次倍比稀釋(見表3)，每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡雞胚，0.1 mL/胚。雞胚接種后置37 ℃繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察144 h，同時(shí)設(shè)PBS對照組。試驗(yàn)重復(fù)3次。不同稀釋度中和產(chǎn)物接種后的雞胚死亡率計(jì)算同1.5。

1.7 中和劑鑒定試驗(yàn) 依照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282號)規(guī)定的試驗(yàn)程序，采用懸液定量法進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。3種消毒劑各設(shè)6組試驗(yàn)。第1組：消毒劑900 μL+病毒液100 μL；第2組：(消毒劑900 μL+病毒液100 μL)100 μL+中和劑900 μL；第3組：中和劑900 μL+病毒液100 μL；第4組：(消毒劑100 μL+中和劑900 μL)900 μL+病毒液100 μL；第5組：PBS液900 μL+病毒液100 μL；第6組：中和劑500 μL+ PBS 500 μL。基于1.5和1.6結(jié)果，為避免消毒劑對雞胚的毒性作用，癸甲溴銨溶液和戊二醛苯扎溴銨溶液分別稀釋1 000倍和100倍后使用。

上述各組中兩兩液體均于混勻后作用10 min。每組作用產(chǎn)物經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.1 mL/胚。雞胚接種后繼續(xù)孵育并觀察120 h。試驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果評判：第1、2、6組雞胚應(yīng)全部存活，其余3組全部死亡。

1.8 消毒劑對NDV滅活效果測定 采用懸液定量法進(jìn)行。按消毒劑說明書推薦的最高使用濃度漸次稀釋，將不同稀釋度的消毒劑0.9 mL分別與0.1 mL 103倍稀釋的新鮮病毒液混合，室溫下分別作用10 min、 20 min和30 min。從消毒劑與病毒液不同時(shí)間作用產(chǎn)物中各取0.1 mL加入到0.9 mL中和劑中，混勻后作用10 min。中和后的溶液10倍系列稀釋至10-4，將100、10-1、10-2、10-3和10-4五個(gè)稀釋度溶液分別經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚。同時(shí)設(shè)不加消毒劑的對照樣品，以0.9 mL PBS代替消毒劑。雞胚接種后置37 ℃繼續(xù)孵育并觀察120 h。采用血凝(HA)試驗(yàn)逐個(gè)測定死亡胚尿囊液雞紅細(xì)胞凝集價(jià)，然后根據(jù)測定結(jié)果分別計(jì)算各試驗(yàn)樣品和對照樣品的ELD50。試驗(yàn)重復(fù)3次。依下式計(jì)算不同濃度消毒劑對病毒的殺滅率[11]。以能完全滅活病毒的消毒劑最低濃度作為最低殺滅病毒濃度。

消毒劑對病毒殺滅率(%)=(對照樣品ELD50-試驗(yàn)樣品ELD50)/對照樣品ELD50×100%

1.9 消毒劑連續(xù)使用穩(wěn)定性試驗(yàn) 按產(chǎn)品使用說明書分別配制0.1 g/L癸甲溴銨溶液、5 g/L聚維酮碘溶液和10 mL/L戊二醛苯扎溴銨溶液(含戊二醛和苯扎溴銨各1 g/L)消毒工作液，室溫下放置，定期取樣測定其殺滅NDV的效果(方法同1.8)，觀察消毒劑工作液的使用有效期。

2 結(jié)果

2.1 消毒劑對雞胚的最大安全劑量 癸甲溴銨溶液和戊二醛苯扎溴銨溶液對雞胚有一定的毒性作用，其稀釋度分別≤1∶640和≤1∶80時(shí)，按0.1 mL/胚劑量經(jīng)尿囊腔接種10日齡雞胚，雞胚可發(fā)生死亡。而聚維酮碘溶液對雞胚基本無毒性。平均雞胚死亡率結(jié)果見表2。

表2 消毒劑對雞胚的最大安全劑量測定Table 2 Determination of the maximum safe doses of disinfectants to chicken embryo (%)

2.2 消毒劑與中和劑的中和產(chǎn)物對雞胚的毒性 癸甲溴銨溶液和戊二醛苯扎溴銨溶液與相應(yīng)中和劑的作用產(chǎn)物對雞胚仍有一定的毒性，而聚維酮碘溶液與中和劑的作用產(chǎn)物對雞胚無毒性。平均雞胚死亡率結(jié)果見表3。

表3 消毒劑與中和劑的中和產(chǎn)物對雞胚的毒性測定Table 3 Toxicity determination of neutralization products of disinfectants and neutralizers to chicken embryo (%)

2.3 中和劑鑒定 結(jié)果顯示，3種消毒劑的第1、2、6組雞胚均全部存活，其余各組雞胚全部死亡(見表4)，表明選用的中和劑均可有效中和相應(yīng)稀釋度消毒劑的滅活NDV能力，其本身對雞胚無毒性作用，也無滅活病毒能力。

表4 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of neutralizer appraisal tests (%)

2.4 消毒劑殺滅NDV的效果 結(jié)果表明，按作用10 min計(jì)，癸甲溴銨溶液、聚維酮碘溶液和戊二醛苯扎溴銨溶液完全殺滅NDV的最高稀釋度分別為1∶20 000、1∶2 250和1∶3 750。按有效成分計(jì)，則癸甲溴銨最低殺滅NDV濃度為25 mg/L，聚維酮碘約為44.44 mg/L，戊二醛苯扎溴銨溶液為0.27 mL/L(含戊二醛和苯扎溴銨各約為26.67 mg/L)。此外，在一定濃度下，消毒劑的殺毒效果隨作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。平均雞胚死亡率結(jié)果見表5、6、7。

表5 癸甲溴銨溶液殺滅NDV效果測定Table 5 Virucidal efficacy of deciquam solution against Newcastle disease virus (%)

表6 聚維酮碘溶液殺滅NDV效果測定Table 6 Virucidal efficacy of povidone iodine solution against Newcastle disease virus (%)

表7 戊二醛苯扎溴銨溶液殺滅NDV效果測定Table 7 Virucidal efficacy of glutaral and benzalkonium bromide solution against Newcastle disease virus (%)

2.5 消毒劑連續(xù)使用穩(wěn)定性 配制的3種消毒劑的消毒工作液，室溫下放置，定期取樣測定其殺滅NDV的效果。結(jié)果表明，5 g/L聚維酮碘工作液完全殺滅病毒的時(shí)間可保持10 d，存放15 d時(shí)，殺毒效果開始有所下降，至20 d時(shí)，作用10 min、20 min和30 min的病毒殺滅率分別降至0、12.24%和34.19%。此外，隨存放時(shí)間的延長，液體的顏色逐漸變淡，直至無色。0.1 g/L癸甲溴銨工作液完全殺滅病毒的時(shí)間可保持135 d，存放150 d時(shí)殺毒效果開始下降。10 mL/L戊二醛苯扎溴銨工作液放置180 d依然保持完全殺滅病毒的效果。

3 討論

本研究測定了3種消毒劑對雞胚的最大安全劑量。結(jié)果表明，除聚維酮碘溶液外，癸甲溴銨和戊二醛苯扎溴銨溶液對10日齡雞胚均有一定的毒性作用，中和劑也不能降低其毒性。因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意消毒劑的使用濃度，以免對動(dòng)物造成傷害。

癸甲溴銨是一種雙鏈季銨鹽陽離子表面活性劑，其帶正電荷的季銨陽離子能主動(dòng)吸引并富集于帶負(fù)電荷的病原表面，導(dǎo)致其膜的通透性發(fā)生改變，酶和結(jié)構(gòu)蛋白變性，抑制病原的新陳代謝[12]。溴離子能滲透到胞漿膜脂質(zhì)層及蛋白質(zhì)層，改變膜的通透性。癸甲溴銨對多數(shù)細(xì)菌、真菌和藻類有殺滅作用，對親脂性病毒也有一定作用。其殘留藥效長，對光和熱穩(wěn)定。適用于動(dòng)物廄舍、飼喂器具、飲水等消毒。推薦使用濃度(以癸甲溴銨計(jì))為：廄舍、器具消毒150～500 mg/L，飲水消毒25～50 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)，癸甲溴銨最低有效殺滅NDV濃度為25 mg/L，與推薦的最低使用濃度一致。

聚維酮碘系碘與1-乙烯基-2-吡咯烷酮均聚物形成的絡(luò)合物，具有性能穩(wěn)定、不揮發(fā)、易溶于水、無黃染等優(yōu)點(diǎn)。它通過游離碘碘化和氧化病原體蛋白的活性基團(tuán)，并與蛋白的氨基結(jié)合而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和抑制菌體的代謝酶系統(tǒng)，對細(xì)菌、病毒和真菌均有良好的殺滅作用[13]，是一種中效低毒的廣譜消毒劑，特別適用于黏膜和創(chuàng)面消毒，也可用于飲水和養(yǎng)殖器具的消毒。本研究結(jié)果表明，聚維酮碘最低有效殺滅NDV濃度約為44.44 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于推薦的最低使用濃度1 g/L。

戊二醛苯扎溴銨溶液是以戊二醛、苯扎溴銨為主要成分的復(fù)方消毒劑。戊二醛屬醛類高效消毒劑，主要是通過醛基作用于病原體蛋白的巰基、羥基、羧基和氨基，使之烷基化，引起蛋白質(zhì)凝固造成細(xì)菌死亡。具有廣譜、高效、低毒、受有機(jī)物影響小、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可殺滅細(xì)菌的繁殖體和芽孢、真菌、病毒。苯扎溴銨又名新潔爾滅，為單鏈季銨鹽陽離子表面活性劑，其作用機(jī)制與其他季銨鹽類消毒劑相同。兩者合用，具有增效作用。主要用于養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖器具的消毒。本研究結(jié)果表明，戊二醛苯扎溴銨溶液殺滅基因VII型NDV最低有效濃度約為0.27 mL/L，作用10 min。高富紅等[8]報(bào)道戊二醛苯扎溴銨溶液殺滅NDV LaSota株的最低有效濃度為0.625 mL/L(1∶1 600稀釋)，最短有效時(shí)間為5 min。鑒于他們試驗(yàn)中采用的是消毒劑與病毒液按1∶1比例的作用體系，因此，其實(shí)際最低有效濃度應(yīng)約為0.313 mL/L，與本研究結(jié)果基本一致。

總之，在試驗(yàn)條件下，3種消毒劑在推薦使用濃度范圍內(nèi)，對NDV均有良好的滅活效果。其消毒效果與濃度及作用時(shí)間有一定的相關(guān)性，濃度越高，作用時(shí)間越長，消毒效果越強(qiáng)。需要注意的是，除消毒劑的濃度、作用時(shí)間外，環(huán)境溫度、酸堿度、有機(jī)物的存在以及消毒方式(如噴霧、浸泡)等諸多因素均可影響其殺毒效果。在實(shí)際使用過程中，應(yīng)采取規(guī)范的消毒方法和程序，如先對禽舍、器具進(jìn)行徹底清掃、沖洗，待其干燥后再用消毒劑消毒，以保證消毒效果。

配制的消毒劑工作液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，聚維酮碘和癸甲溴銨溶液完全殺滅NDV的時(shí)間可分別保持10 d和135 d，而戊二醛苯扎溴銨溶液至少可保持180 d，基本與它們各自的理化特點(diǎn)相符。然而，在實(shí)際消毒工作中，配制的消毒液應(yīng)盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間存放。