鐵死亡的發(fā)生機制及其在肺癌中的研究進展

吳金銘 馬麗芳 王佳誼 喬永霞

鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種區(qū)別于細胞凋亡和細胞壞死的程序性細胞死亡，這一過程的特點是依賴鐵離子及活性氧（reactive oxygen species, ROS）誘導脂質過氧化物（lipid peroxides, LPO）堆積。磷脂中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）、氧化還原活性鐵以及LPO的修復缺陷是鐵死亡的3個特征，它們決定了腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性[1-3]。腫瘤細胞比正常細胞更依賴鐵來促進其高增殖率，這種現(xiàn)象被稱為鐵成癮（iron addition）[4]。

肺癌是全球上最常見的惡性腫瘤之一，在2018年估計有210萬新病例和近170萬人死亡[5]，而肺癌發(fā)病率和死亡率在我國居所有腫瘤第一位[6]。肺癌病理類型主要有非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），前者又分為肺鱗癌（squamous cell carcinoma, SCC）、肺腺癌（adenocarcinoma, ADC）、大細胞肺癌等[7]，近年來肺癌病理類型以ADC的上升和SCC的下降為主要趨勢[8]。

鐵死亡的發(fā)現(xiàn)使得人們對于腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展有了新的認識。誘導鐵死亡對于腫瘤治療的重要性已經(jīng)越來越受到重視，同時研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞會產(chǎn)生鐵死亡抵抗。在治療肺癌的藥物中，有一些已被證實可以誘導鐵死亡，研究也發(fā)現(xiàn)肺癌細胞中存在鐵死亡抑制的現(xiàn)象。那么，闡明鐵死亡受抑的機制、誘導鐵死亡發(fā)生對于治療肺癌有著重要的臨床意義。

1 鐵死亡的發(fā)生機制

鐵死亡發(fā)生的主要原因是細胞代謝方式產(chǎn)生改變，使細胞內(nèi)LPO和ROS大量累積。在鐵死亡過程中，主要有4條代謝通路發(fā)生改變。

1.1 谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成通路受抑 細胞表面存在胱氨酸/谷氨酸轉運體（cystine/glutamate antiporter,system Xc-）以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，促使胱氨酸進入細胞，隨后將其還原為半胱氨酸，將多余谷氨酸排出細胞，為細胞內(nèi)GSH合成提供原料，同時GSH是谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）降解LPO的必需反應底物[9]。當GSH合成通路受抑時，LPO積累，鐵死亡發(fā)生。

1.2 鐵元素大量累積 鐵元素如何促進鐵死亡尚不完全明確，如今公認的解釋為二價鐵離子可轉移電子給胞內(nèi)氧，使后者和脂質發(fā)生反應形成LPO[10]。Fe2+在微酸性條件下和腫瘤細胞內(nèi)H2O2反應生成高活性的羥基自由基（·OH），即發(fā)生所謂的芬頓（Fenton）反應，·OH進而與細胞內(nèi)的脂質體反應生成LPO[11]。

鐵元素的吸收、消耗、儲存以及周轉都會對鐵死亡的敏感性產(chǎn)生影響。轉鐵蛋白（transferrin, TRF）以及轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1, TFR1）可將胞外鐵元素轉運入細胞[12]，多余的鐵儲存在鐵蛋白中，各類鐵蛋白可以通過維持鐵穩(wěn)態(tài)負性調(diào)節(jié)鐵死亡過程。

1.3 脂質合成亢進 一些谷氨酰胺轉運蛋白如SLC1A5存在于細胞表面，將細胞內(nèi)萘乙酸排出細胞外以吸收外部谷氨酰胺。谷氨酰胺進一步合成谷氨酸、α-酮戊二酸，并最終產(chǎn)生脂質。如果脂質合成受刺激，它將提供形成LPO的原料，從而促進鐵死亡[12]。

（2）從初投資和運行費用來看，加裝中間換熱器的地下水源熱泵系統(tǒng)和空氣源熱泵相比，在初投資上增加了136%，在運行費用上也增加6.3%，因此，對于家用中央空調(diào)采用加裝中間換熱器的地下水源熱泵系統(tǒng)在經(jīng)濟上是不合適的。

1.4 補償GPX4缺失的酶催化系統(tǒng) 除了上述3種代謝通路調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生，最新的一些研究鑒定出了獨立于經(jīng)典的GPX4通路的鐵死亡抑制因子（ferroptosis suppressor protein 1, FSP1），并且發(fā)現(xiàn)FSP1的豆蔻酰化修飾對于抑制鐵死亡的活性非常關鍵。

此外，其他細胞代謝機制例如甲羥戊酸、NADPH、硒元素以及聚胺代謝均可以影響鐵死亡敏感性[13,14]，因此鐵死亡是一種與細胞代謝密切相關的細胞程序性死亡。

2 肺癌中鐵死亡受抑

近年來，一些研究者發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞中普遍存在鐵死亡被抑制的現(xiàn)象。肺部組織較其他組織處于高氧濃度的環(huán)境中，這種特殊環(huán)境使得肺部腫瘤需要承受很大的氧化壓力。因此肺癌細胞為了避免在轉化過程中出現(xiàn)被易化和強化的鐵死亡，采取了多種措施提高鐵死亡的誘導閾值，從而導致鐵死亡受抑，進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

2.1 GSH合成通路上調(diào) Huang等[15]和Ji等[16]發(fā)現(xiàn)肺癌細胞通過上調(diào)System Xc-，直接靶向GSH，增加細胞抗氧化能力。SLC7A11（xCT）和SLC3A2是System Xc-的重要組成部分，其在腫瘤細胞系集中表達，表明這些細胞中的System Xc-活性可能更高。Huang等[15]利用寡核苷酸芯片發(fā)現(xiàn)，9株肺癌細胞株中，A549、HOP-62、NCI-H226、NCI-H322M和NCI-H460這5株細胞中SLC7A11呈高表達；其中A549中SLC7A11和SLC3A2表達量最高。Ji等[16]研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11在NSCLC細胞的胞質膜中高表達，以促進氣道上皮細胞的增殖和谷氨酰胺依賴性，并降低ROS的產(chǎn)生，抑制了鐵死亡。

Lai等[17]則發(fā)現(xiàn)肺癌細胞通過直接上調(diào)GPX4的表達來抑制鐵死亡，絲氨酸蘇氨酸酪氨酸激酶1（serine threonine tyrosine kinase 1, STYK1）在NSCLC細胞SW900中高表達，進而促進GPX4的表達，促進了肺癌細胞的增殖，減弱了由鐵死亡引起的多種線粒體異常，導致鐵死亡在NSCLC中受到抑制。

2.2 鐵元素減少 鐵死亡是一種鐵依賴的細胞死亡方式，鐵代謝方面的改變也會抑制鐵死亡。Kukulj等[18]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者肺癌組織中普遍高表達鐵蛋白，血清鐵蛋白表達增加，研究發(fā)現(xiàn)，血清鐵蛋白越高，提示腫瘤患者遠期預后越差。Ji[19]等發(fā)現(xiàn)鐵蛋白大于300 mg/L的肺癌患者生存率明顯降低。Shi等[20]發(fā)現(xiàn)鐵蛋白水平在肺癌遠處轉移方面有統(tǒng)計學差異，低鐵蛋白水平組的鉑類藥物化療反應率也高于高水平組。這可能是因為，H-鐵蛋白（鐵蛋白H亞基）具有鐵氧化酶活性，基于這個特性能夠催化高毒性的二價鐵轉化為低毒性的三價鐵，不穩(wěn)定鐵池（labile iron pool, LIP）水平降低，因此抑制了Fenton反應，抑制了鐵死亡[21]。除了抗氧化外，異常表達的鐵蛋白還可以通過免疫抑制、促進血管生成，促進細胞增殖等途徑，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。

Alvarez[23]等發(fā)現(xiàn)肺癌組織和細胞系中鐵硫簇合生物合成酶1（iron-sulfur cluster biosynthetic enzyme, NFS-1）普遍高表達，進一步實驗發(fā)現(xiàn)NSF-1從半胱氨酸中收集更多的硫元素產(chǎn)生鐵硫簇，細胞釋放鐵減少，明顯緩解了高氧誘導的細胞鐵死亡，動物實驗中也發(fā)現(xiàn)NSF-1敲除后細胞成瘤時間明顯延長，這表明為了克服高氧誘導的細胞鐵死亡，肺癌發(fā)生過程中存在對NSF-1的陽性選擇。

2.3 脂質合成抑制 鐵死亡的特點之一是LPO大量累積，因此脂質合成受抑制也會抑制肺癌中的鐵死亡。Jiang等[24]發(fā)現(xiàn)肺癌細胞通過淋巴樣特異性解旋酶（lymphoid-specific helicase, LSH）調(diào)節(jié)脂質代謝來對抗鐵死亡，LSH作為一種DNA甲基化修飾劑，通過激活脂質代謝相關基因，包括葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1, GLUT1）、鐵死亡相關基因固醇輔酶A去飽和酶1（sterol-CoA desaturase 1, SCD1）和脂肪酸去飽和酶2（fatty acid desaturase 2,FADS2），與WDR76蛋白（WD40蛋白家族成員）相互作用抑制鐵死亡，研究觀察到LSH過表達通過降低細胞內(nèi)鐵和ROS的水平來抑制鐵死亡。這一機制也從表觀遺傳學角度解釋了鐵死亡受抑制現(xiàn)象。

2.4 補償GPX4缺失的酶催化系統(tǒng) 除了傳統(tǒng)的GPX4通路，最新的研究發(fā)現(xiàn)FSP1是獨立于GPX4通路之外的鐵死亡抑制因子。有研究[25]采用了合成致死CRISPR-Cas9的篩選方案，發(fā)現(xiàn)FSP1豆蔻酰化修飾后定位于細胞質膜，在質膜中，F(xiàn)SP1作為一種氧化還原酶，降低輔酶Q10（coenzyme Q10, CoQ10）水平，生成親脂自由基捕獲型抗氧化劑（radical-trapping antioxidant, RTA），阻止LPO的增殖，進一步發(fā)現(xiàn)FSP1在肺癌細胞的培養(yǎng)和小鼠腫瘤移植中介導抗鐵死亡作用。在肺癌細胞中，當GPX4失活后，F(xiàn)SP1的存在能夠維持肺癌細胞的生長。而Doll等[26]則通過在GPX4缺失的情況下進行篩選，找到能夠補償GPX4缺失引起鐵死亡的FSP1蛋白。他們也發(fā)現(xiàn)在FSP1的N端存在經(jīng)典的豆蔻酰化修飾的基序，會完全影響其抗鐵死亡的能力。FSP1過表達的情況下，鐵死亡被抑制。

2.5 其他途徑 同樣涉及到LSH，Wang等[27]的研究則首次揭示了長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, LncRNA）作為競爭性內(nèi)源RNA抑制肺癌細胞鐵死亡的新機制，提示表觀遺傳修飾影響鐵死亡的另一種途徑：RNA測序發(fā)現(xiàn)LSH上調(diào)LncRNA LINC00336的表達，并在ADC臨床樣本中驗證了LINC00336的異常高表達，LSH通過抑制p53活性而上調(diào)RNA結合蛋白ELAV1（ELAV-like RNA-binding protein 1, ELAVL1）表達，ELAVL1則通過與LINC00336結合而提高其穩(wěn)定性，進而LINC00336作為競爭性內(nèi)源RNA吸附微小RNA（microRNA, miR）6852并降低MIR6852活性，從而使miR6852靶基因胱硫醚β-合酶（cystathionine-β-synthase, CBS）表達上調(diào)，CBS是鐵死亡的替代標志物，最終抑制鐵死亡而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

肺癌中鐵死亡受抑是個復雜的過程且相關分子機制尚不清楚，目前為止尚缺乏在臨床標本水平較深入闡明鐵死亡及相關代謝與肺癌間相關性的研究。而針對臨床中ADC的比例越來越高，上述肺癌細胞系涵蓋了ADC、SCC等NSCLC以及大細胞肺癌等，并沒有特定研究說明ADC與鐵死亡之間有獨特的抑制通路。

現(xiàn)將全球主要針對肺癌中鐵死亡受抑研究情況匯總于表1中。

3 誘導鐵死亡與肺癌治療

從認識到鐵死亡是一種獨特的調(diào)節(jié)性死亡模式，越來越多的研究表明鐵死亡是抗癌療法發(fā)展的新機遇[28]。鐵死亡可由4類化合物引發(fā)，這些化合物稱為鐵死亡誘導劑（ferroptosis-inducing agents, FINs）[28,29]。此外還有一些新型材料或藥物誘導鐵死亡的發(fā)生。

3.1 已有的臨床藥物 實際上，在已有的肺癌經(jīng)典治療中，一些治療藥物被揭示其抑癌機制與鐵死亡有關。研究[30]發(fā)現(xiàn)順鉑是NSCLC A549細胞的鐵死亡和凋亡的誘導因子，順鉑引起的還原型GSH的耗竭和GPX4的失活在其機制中起著重要作用，進一步發(fā)現(xiàn)順鉑與I類FIN Erastin聯(lián)合治療對其抗腫瘤活性有顯著的協(xié)同作用。而其他肺癌一線治療藥物，如替尼類藥物、單抗藥物、長春瑞濱、紫杉醇等藥物，暫時未有詳盡研究這些藥物與鐵死亡關系的實驗。有參考價值的是乳腺癌藥物拉帕替尼與抗焦慮藥物西拉美新的組合通過降低TRF和鐵蛋白的表達，增加LIP，誘導乳腺癌細胞鐵死亡[31]。因此，一線肺癌治療藥物與鐵死亡之間的關系尚需要大量研究來闡明。

3.2 理論上的FINs

3.2.1 I類FIN I類FIN（例如Erastin及其功能相關化合物）可抑制System Xc-，進而抑制下游半胱氨酸以及GSH的合成[32]，最終導致LPO累積和鐵死亡發(fā)生。Erastin及其類似物哌嗪酮類erastin已被證實在宮頸癌、卵巢癌和纖維肉瘤的動物模型中抑制腫瘤生長[28,33,34]。

具體到誘導鐵死亡治療肺癌中，免疫抑制藥物柳氮磺胺嘧啶（sulfasalazine, SASP）被發(fā)現(xiàn)顯著降低了GSH水平，抑制了NCI-H69和LU6-SCLC組織異種移植物的生長[35]?？拱┧幬锼骼颇幔╯orafenib）也被發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞系NCI-H460誘導了鐵死亡[36]，這可能是由于索拉菲尼能夠阻斷System Xc-，抑制GSH的合成。

3.2.2 II類FIN II類FIN直接與GPX4交互并抑制其功能。Ras選擇性致死性小分子3（ras-selective lethal small molecule 3, RSL3）與GPX4的親核活性位點硒代胱氨酸共價相互作用，并抑制其酶促活性，導致其脂質修復功能喪失、LPO積累以及隨后的細胞鐵死亡[3]。盡管II類FIN的藥代動力學差[37]，但在未來可能具有癌癥治療的潛力。

表 1 肺癌中鐵死亡受抑相關研究進展Tab 1 Research progress on ferroptotic suppression in lung cancer

3.2.3 III類FIN III類FIN如FIN56通過直接靶向并激活甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway）下游的、參與膽固醇合成的角鯊烯合成酶（squalene synthase, SQS）促進鐵死亡，使得一些代謝物如脂溶性抗氧化劑CoQ10和SectRNA受抑制[38]，間接耗竭或滅活GPX4。他汀類藥物如西力伐他汀、辛伐他汀等可抑制甲羥戊酸途徑的限速酶HMG CoA還原酶，通過消耗CoQ10抑制下游tRNA使細胞對鐵死亡敏感[39]。

3.2.4 IV類FIN 這一類物質主要增加LIP或氧化鐵的水平，導致LPO積累，通常被稱為非經(jīng)典鐵死亡誘導[29]。

血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HMOX1）催化血紅素降解為鐵、膽綠素和一氧化碳，因而提高LIP的水平來增強鐵死亡[40,41]。用含鐵化合物（如氯化鐵、血紅蛋白、血紅素或硫酸亞鐵銨）處理某些細胞會引發(fā)鐵死亡[40,42-44]。1,2-二氧戊環(huán)（1,2-dioxolane, FINO2）直接氧化鐵，間接抑制GPX4，導致腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡[45,46]。

可以看到，體外發(fā)現(xiàn)的可誘導鐵死亡的藥物可明顯抑制腫瘤細胞的生長，盡管II類、III類、IV類FIN還未進行體內(nèi)實驗。這些鐵死亡誘導小分子的優(yōu)點可以預測到，它們很容易在體內(nèi)代謝或清除，以防止低長期毒性。然而，由于腎臟的快速清除，藥物靶向差，腫瘤部位的堆積較低[40]。此外，這些藥物的副作用是明顯的，因為正常細胞同時受到了損傷[47]。因此，穩(wěn)定、持續(xù)地誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡的藥物還有待進一步研究。

3.3 鐵死亡治療新展望

3.3.1 氧化鐵納米粒子（iron-oxide nanoparticles, IO NPs）鐵基材料是一種理想的腫瘤治療方法，因為鐵本身是產(chǎn)生ROS的Fenton反應的關鍵成分，這些材料可以通過被動和主動靶向聚集在腫瘤部位，然后釋放亞鐵或鐵離子的酸性溶酶體，參與Fenton反應和誘導鐵死亡殺死腫瘤細胞[48]，大大降低了鐵死亡的不利影響?；谶@些特性，人們開發(fā)了許多新的高效的方法，通過改變納米材料的鐵相關特性可以顯著提高納米材料的抗癌效率。

治療缺鐵性貧血的藥物Ferumoxytol已被用于抑制早期乳腺癌和肺癌在肝、肺轉移的生長[49]。順鉑負載的IO NPs誘導鐵死亡，既增強了順鉑抗癌活性，同時最小化了全身毒性[50]。

3.3.2 腫瘤免疫治療 近年來腫瘤免疫治療越來越受到重視，活化的淋巴細胞可以特異性識別腫瘤細胞并通過釋放穿孔素和顆粒酶來誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。研究[51]還發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫治療后，活化的CD8+T細胞釋放的γ-干擾素（interferon-γ, IFNγ）會下調(diào)SLC7A11和SLC3A2的表達，從而抑制腫瘤細胞對胱氨酸的攝取，增強腫瘤細胞的脂質過氧化和鐵死亡，并且PD-L1抗體與胱氨酸降解酶偶聯(lián)物cyst(e)inase聯(lián)合治療可以加強T細胞抗腫瘤效應。

3.3.3 腫瘤放射治療 實驗觀察發(fā)現(xiàn)電離輻射（ionizing radiation, IR）后，LPO增加而GSH含量降低[52]，并且能通過瞬態(tài)的水輻射分解和線粒體的變化產(chǎn)生氧自由基和ROS[53,54]，從而損壞核酸、蛋白質和脂質并引起細胞損傷乃至死亡，這強烈提示鐵死亡在放療的抗腫瘤效應中發(fā)揮了作用。而在最新的研究[55]發(fā)現(xiàn)，放療后腫瘤細胞呈現(xiàn)典型的鐵死亡形態(tài)學變化—線粒體濃縮，膜密度增高，線粒體脊減少，也即放療可以通過產(chǎn)生大量ROS，并上調(diào)關鍵酶的表達，共同促進脂質過氧化，最終導致鐵死亡；更為重要的是，在后續(xù)的實驗中，用肺癌細胞系測試了I類、II類、III類FINs的放射增敏作用，發(fā)現(xiàn)所有測試的FINs聯(lián)合放療都可以協(xié)同誘導脂質過氧化和鐵死亡，并且明顯增加腫瘤細胞對放療的敏感性。

現(xiàn)將已有的與鐵死亡相關的有臨床應用潛能的藥物和化合物匯總于表2中。

綜上所述，鐵死亡的發(fā)現(xiàn)，為肺癌的治療開辟了許多新的路徑。不僅現(xiàn)有的一些藥物治療和放射治療被發(fā)現(xiàn)可以誘導鐵死亡，更多的FINs被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤的生長，盡管在肺癌治療上的研究并沒有開展很多。如何發(fā)現(xiàn)更多的FINs并進行體內(nèi)實驗，如何誘導肺癌細胞發(fā)生鐵死亡的同時，保護其他正常細胞免受損害，是未來亟需解決的問題。

表 2 鐵死亡誘導治療相關的臨床藥物和化合物Tab 2 Clinical drugs and compounds related to ferroptosis-inducing treatment

4 結論和展望

鐵死亡作為近年來發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于細胞凋亡、壞死、自噬的一種新的鐵依賴性程序性死亡，有著獨特的發(fā)生和抵抗機制，其在腫瘤治療上的重要性已經(jīng)得到證實，越來越多的靶向鐵死亡治療也正在研究中。而腫瘤細胞中鐵死亡受到抑制這一現(xiàn)象亦受到廣泛關注，目前為止尚缺乏具體的研究探究其機制。肺癌作為最常見的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率、死亡率位于第一，但是肺癌中鐵死亡抑制與鐵死亡治療方面的研究目前還接近于空白。本文綜述了肺癌中鐵死亡受抑制的研究進展，同時介紹了誘導鐵死亡治療肺癌的情況，并將開展研究試圖明確肺癌中鐵死亡受抑制的機制，以期為肺癌治療提供新思路以及為肺癌患者的生存和死亡提供新的診斷和治療方法。