下調(diào)HOTA I R 通過提高P T EN表達(dá)逆轉(zhuǎn)HCC827細(xì)胞吉非替尼耐藥

翟陽(yáng) 陳茜 王玉珍 李旭 李麗娜

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居全球及中國(guó)惡性腫瘤中的首位，其中約80%以上為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）[1]，目前分子靶向治療已成為NSCLC治療的主要手段之一，其中以吉非替尼（Gefitinib）為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factot receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）具有突出的成效，但晚期NSCLC患者一線使用Gefitinib靶向治療的中位疾病無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival, PFS）僅為9.6個(gè)月[2]，因此，探索EGFR-TKIs耐藥機(jī)制、尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑成為了亟待解決的問題。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是長(zhǎng)度超過200 nt的一類非編碼內(nèi)源性RNA，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，因lncRNA缺乏明顯的開放閱讀框而不能編碼蛋白質(zhì)，但卻能夠通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學(xué)水平對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行調(diào)控[3-5]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）定位于人類染色體12q13.13，長(zhǎng)度為2,364bp，既往研究[6-8]表明，HOTAIR異常表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，能夠通過雙向結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2, PRC2）和賴氨酸特異性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1, LSD1）修飾靶基因組蛋白并使下游基因沉默，同時(shí)能夠促進(jìn)上皮-間質(zhì)化過程并能同腫瘤抑制因子及微小RNA（microRNAs, miRNAs）相互作用，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，并參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在NSCLC患者組織中呈高表達(dá)，且參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過程。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR能夠通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路與第10號(hào)染色體缺失的張力蛋白同源的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）結(jié)合，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。Li等[11]發(fā)現(xiàn)在人喉部鱗癌中，HOTAIR可誘導(dǎo)PTEN的甲基化和下調(diào)，導(dǎo)致PI3K/AKT通路活性增加，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Chen等[12]在乳腺癌中也得出了一致的結(jié)果。提示我們HOTAIR能夠通過激活PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控腫瘤的作用。

本研究采用質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將體外合成的針對(duì)HOTAIR的siRNA轉(zhuǎn)染HCC827GR入細(xì)胞中，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HOTAIR的靶基因，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）及Western blot方法檢測(cè)HOTAIR及PTEN、PI3K、AKT的表達(dá)水平，同時(shí)采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吉非替尼半抑制濃度（50%inhibitory concentration, IC50），運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡率及生長(zhǎng)周期的變化。從體外實(shí)驗(yàn)證明下調(diào)HOTAIR表達(dá)可以通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路，抑制HCC827細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并可以逆轉(zhuǎn)HCC827GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，下調(diào)HOTAIR表達(dá)可能成為逆轉(zhuǎn)NSCLC患者EGFR-TKIs耐藥的新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集2019年1月-2020年1月陜西省腫瘤醫(yī)院確診的NSCLC患者外周血血清7例，其中吉非替尼治療有效患者4例，耐藥患者3例，男性3例，女性4例，平均年齡（65.7±10.3）歲。人肺癌HCC827細(xì)胞株及HCCC827吉非替尼耐藥細(xì)胞株（HCC827GR）由西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存，HCC827GR細(xì)胞為前期參考Fumiaki等[13]在文獻(xiàn)中提供的方法通過低濃度吉非替尼持續(xù)誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞構(gòu)建。用CCK-8法檢測(cè)該細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，計(jì)算IC50在20 μmol/L左右，并且在不加藥培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下，相關(guān)耐藥表型穩(wěn)定至少6個(gè)月，即為構(gòu)建成功。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI-1640培養(yǎng)基加20%胎牛血清（FBS）和100 U/mL的雙抗（均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司），孵箱條件為37 °C，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中（購(gòu)自美FOR-MA公司），0.25%胰酶+0.02% EDTA（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）消化、傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 生物信息 學(xué)分析利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org）及Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測(cè)HOTAIR及PTEN的潛在相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染 按實(shí)驗(yàn)需要分為6組：HCC827組、HCC827GR組、HCC827GR/HOTAIR-NC組、HCC827GR/si-HOTAIR組、HCC827GR/HOTAIR-NC+gefitinib組及HCC827GR/si-HOTAIR+gefitinib組。si-HOTAIR序列為5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，陰性對(duì)照（negative control, NC）序列為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成) ，轉(zhuǎn)染前1天將（4-5）×104細(xì)胞接種在24孔板上，培養(yǎng)于37 °C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。第二天將稀釋好的siRNA和lipofectaminTM2000（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）試劑混勻形成siRNA/lipofectamin復(fù)合物，100 μL siRNA/Lipofectamin復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，放入CO2培養(yǎng)箱中37 °C溫育24 h-48 h。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)HOTAIR、PTEN表達(dá)HOTAIR引物上游：5’-TAGGCAAATGTCAGAGGGTT-3’，下游：5’-ACACAAGTAGCAGGGAAAGG-3’；PTEN引物上游：5’-CTATTCCCAGTCAGAGGCGCTAT-3’；下游：5’-TGAACTTGTCTTCCCGTCGTGT-3’；GAPDH: 上游：5’-ATTGATGGAT GCTAFGAGTATT-3’，下游：5’-AGTCTTCTGGGTGGCA GTGA T-3’（由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成）。結(jié)果判讀：擴(kuò)增完畢后行溶解曲線分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用公式：采用公式：2-ΔΔCq［ΔΔCq = Cq（target gene）- Cq（GAPDH）］計(jì)算各指標(biāo)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。以上步驟重復(fù)3次。

1.6 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT蛋白表達(dá)選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白并采用BCA法定量（BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自陜西先鋒生物科技有限公司），取30 μg蛋白，加入等體積2×loading buffer，煮沸5 min。配制10% SDS-PAGE膠，將凝膠玻璃固定于電泳裝置上，加入電泳緩沖液，將樣品短暫離心，用微量上樣器吸取適量樣品，緩慢加入蛋白Marker及樣品，之后在外槽中加入適量電泳緩沖液; 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入封閉液稀釋好的一抗c-MET及β-actin（稀釋比為1:2,000），密封條件下于4 °C 冰箱過夜。洗膜后加入封閉液稀釋好的二抗（稀釋比為 1:2,000），室溫下于搖床上溫和搖動(dòng)2 h。洗膜、發(fā)光，ECL顯影5 min。采用圖像采集系統(tǒng)對(duì)X線片結(jié)果進(jìn)行掃描取圖，利用Image J 軟件對(duì)所攝圖片進(jìn)行灰度值分析及比較。各組樣品目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的灰度值比值為其最終統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。每組重復(fù)3次。

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的藥物敏感性 將HCC827GR細(xì)胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于96孔板，置于37 °C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔中加入不同濃度梯度的吉非替尼，各濃度設(shè)5孔，并設(shè)調(diào)零孔（只有培養(yǎng)液）和對(duì)照孔（培養(yǎng)基+藥物溶解劑+細(xì)胞）。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后：每孔加入滅菌的5mg/mL MTT（美國(guó)Sigma公司）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO液（美國(guó)Sigma公司）150 μL/孔，水平振蕩10 min使紫藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解后置于高通量多功能微板測(cè)試（492 nm）測(cè)定各孔光吸收值（以A表示），以空白孔調(diào)零，取4孔平均值，計(jì)算出細(xì)胞抑制率IR=（1-A/A0）×100%［A：各藥物濃度組光吸收值；A0：未加藥物組（對(duì)照組) 光吸收值］。

1.8 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（購(gòu)自美國(guó)BD公司）HCC827GR細(xì)胞凋亡率的變化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于6孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。再使用 0.25%胰酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)樣品約（0.5-1）×106個(gè)/mL細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液500 μL，重懸細(xì)胞；室溫、避光條件下加入7-AAD染液5 μL（陜西先鋒生物科技有限公司) ，室溫避光孵育5 min-15 min，再加入Binding buffer 450 μL，混勻，使抗體與細(xì)胞充分結(jié)合，加入1 μL Annexin V-PE染液，孵育15min，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.9 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于6孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。再次使用常規(guī)胰酶消化法制成單細(xì)胞懸液; 用含3%小牛血清的70%乙醇固定，4 °C保存過夜；取冷存的細(xì)胞，1,000 r/min×8 min離心，去上清；PBS洗滌2次；加入150 μL RNase（5 g/L）（美國(guó)Sigma公司）和150 μL PI 溶液（50 μg/mL）（美國(guó)Sigma公司）于室溫避光染色30 min；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析G0期/G1期、 S期、G2期/M期細(xì)胞百分比。

1.10Kaplan-MeierPlotter生存分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga）中下載肺腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)。利用肺腺癌患者的生存時(shí)間以及狀態(tài)數(shù)據(jù)結(jié)合HOTAIR及PTEN基因的表達(dá)情況，通過R軟件“survminer”包中的surv_cutpoint函數(shù)選擇最佳的cut-off值并進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析HOTAIR及PTEN基因表達(dá)與總生存期（overall survival, OS）的相關(guān)性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HOTAIR及PTEN表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型分析及Log-rank檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在HCC827GR耐藥細(xì)胞中表達(dá)增高 RT-qPCR結(jié)果顯示HOTAIR在HCC827GR耐藥細(xì)胞中表達(dá)增高（P＜0.01，圖1），提示HOTAIR可能參與介導(dǎo)吉非替尼耐藥。

圖 1 HOTAIR在HCC827GR耐藥細(xì)胞中表達(dá)增高。Fig 1 The expression of HOTAIR increased in HCC827GR cells. **P＜0.01

2.2 下調(diào)HOTAIR后HCC827GR細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)降低 RT-qPCR結(jié)果顯示，HCC827GR/HOTAIR-NC組與HCC827GR組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HCC827GR/si-HOTAIR組與HCC827GR/HOTAIR-NC組相比，轉(zhuǎn)染后HCC827GR細(xì)胞中HOTAIR mRNA的表達(dá)水平下降（70.16±0.57）%，有顯著差異（P＜0.01，圖2）。結(jié)果提示si-HOTAIR 轉(zhuǎn)染可顯著降低細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的HOTAIR。

2.3 下調(diào)HOTAIR逆轉(zhuǎn)HCC827GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示吉非替尼對(duì)轉(zhuǎn)染前后HCC827GR細(xì)胞殺傷作用均隨時(shí)間及濃度遞增，轉(zhuǎn)染后HCC827GR細(xì)胞48 h的IC50為（3.15±0.08）μmol/L，較轉(zhuǎn)染前（18.14±0.17）μmol/L明顯降低（P＜0.01，圖3）。

2.4 下調(diào)HOTAIR可提高HCC827GR細(xì)胞PTEN表達(dá)、降低PI3K及AKT表達(dá) RT-qPCR及Western blot法檢測(cè)分析結(jié)果均顯示，與HCC827細(xì)胞組相比，HCC827GR細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平降低，PI3K及AKT水平升高（P＜0.05）。下調(diào)HOTAIR后的HCC827GR細(xì)胞，相對(duì)于陰性對(duì)照組，細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平升高，而PI3K及AKT的表達(dá)則較前下降，有顯著差異（P＜0.01，圖4）。

2.5 下調(diào)HOTAIR對(duì)HCC827GR細(xì)胞凋亡及周期的影響 我們用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)HCC827細(xì)胞、下調(diào)HOTAIR后的HCC827GR細(xì)胞以及吉非替尼處理過的HCC827GR細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。其中將Annexin V陽(yáng)性7AAD陰性的細(xì)胞為凋亡早期細(xì)胞，Annexin V和7AAD雙陽(yáng)性的細(xì)胞為凋亡晚期或壞死細(xì)胞。分析前上機(jī)細(xì)胞均進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞參數(shù)設(shè)為1萬。結(jié)果顯示，與HCC827細(xì)胞相比，HCC827GR細(xì)胞凋亡率升高，轉(zhuǎn)染組的HCC827GR細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組升高（P＜0.05），吉非替尼聯(lián)合轉(zhuǎn)染組的HCC827GR細(xì)胞凋亡率較單藥吉非替尼處理組明顯升高（P＜0.05，圖5）。HCC827GR細(xì)胞中G0期/G1期細(xì)胞的含量較低，S期細(xì)胞含量較高，而下調(diào) HOTAIR能提高細(xì)胞周期中G0期/G1期細(xì)胞的含量，與陰性對(duì)照組相比，能夠抑制HCC827GR細(xì)胞從G0期/G1期向S期轉(zhuǎn)變，發(fā)生G0期/G1期細(xì)胞周期阻滯（P＜0.05，圖6）。

2.6 吉非替尼耐藥后NSCLC患者血清HOTAIR表達(dá)水平升高 RT-qPCR結(jié)果顯示吉非替尼耐藥后NSCLC患者血清中HOTAIR的表達(dá)水平明顯高于吉非替尼治療有效的NSCLC患者（P＜0.05，圖7）。

2.7 PTEN及HOTAIR表達(dá)與肺腺癌患者的生存的相關(guān)性Kaplan-MeierPlotter生存分析結(jié)果表明肺腺癌患者的OS與PTEN表達(dá)呈正相關(guān)，而與HOTAIR表達(dá)則呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，圖8）。

3 討論

吉非替尼是首個(gè)口服的EGFR-TKIs，2008年IPASS研究結(jié)果[14]顯示，在腺癌、不吸煙或已戒煙的輕度吸煙者的亞裔晚期NSCLC患者的一線治療中，與紫杉醇聯(lián)合卡鉑全身化療相比，吉非替尼組的PFS顯著優(yōu)于化療組，兩組OS無顯著差異。NEJGSG002研究[15]證實(shí)了IPASS的結(jié)果，并提出對(duì)于EGFR突變陽(yáng)性的NSCLC患者，吉非替尼一線治療優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方案化療。然而在臨床中，存在EGFR突變的NSCLC患者吉非替尼的有效維持時(shí)間也僅為8個(gè)月-10個(gè)月，且多數(shù)患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，提示此類藥物存在較嚴(yán)重的獲得性耐藥。

雖然大部分的的EGFR-TKIs獲得性耐藥可用T790M突變及c-MET癌基因的擴(kuò)增解釋，但仍有約30%患者的耐藥原因尚不明確[16]。HCC827是EGFR基因19del突變且對(duì)吉非替尼敏感的人NSCLC細(xì)胞株，我們的前期研究不僅成功構(gòu)建了吉非替尼耐藥細(xì)胞株HCC827GR，并且發(fā)現(xiàn)PTEN基因與肺癌發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，下調(diào)PTEN表達(dá)可以誘導(dǎo)肺腺癌HCC827細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs耐藥[17]，另有研究[18]顯示在NSCLC中，PTEN作為ATK通路上游重要的抑癌基因，可阻止ATK通路的活化，從而阻斷ATK調(diào)控的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，PTEN可能是通過激活PI3K/AKT而減少具有EGFR突變的細(xì)胞的凋亡，提示PTEN缺失可能是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)EGFR-TKIs發(fā)生耐藥的原因之一，但其具體分子機(jī)制仍尚不明確。

圖 2 下調(diào)HOTAIR后HCC827GR細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)降低。Fig 2 The expression of HOTAIR decreased in HCC827GR cells after down-regulation of HOTAIR. ***P＜0.001; NS: no significant.

圖 3 下調(diào)HOTAIR逆轉(zhuǎn)HCC827GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥Fig 3 Down-regulation of HOTAIR increased the sensitivity of HCC827GR cells to gefitinib. IC50: 50% inhibitory concentration.

圖 4 下調(diào)HOTAIR可提高HCC827GR細(xì)胞PTEN表達(dá)，降低PI3K及AKT表達(dá)Fig 4 Down-regulation of HOTAIR can increase the expression of PTEN in HCC827GR cells,and decrease the expression of PI3K and AKT.

近年來新的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以發(fā)揮癌基因及抑癌基因的作用，能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平，與調(diào)節(jié)染色體的蛋白不同，lncRNA發(fā)揮作用不必入核，多以順式調(diào)節(jié)方式發(fā)揮作用。由于lncRNA可以來源于增強(qiáng)子，故其也有增強(qiáng)子樣的作用，同時(shí)lncRNA在胞漿參與調(diào)節(jié)mRNA，并可通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)[19]。大量研究[20-22]表明多種lncRNA參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，并與肺癌患者的預(yù)后及對(duì)化療藥物的耐藥有密切的關(guān)系。HOTAIR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的反義轉(zhuǎn)錄lncRNA，可通過招募PRC2使相應(yīng)組蛋白發(fā)生甲基化，進(jìn)而調(diào)控有關(guān)侵襲轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)進(jìn)而參與癌癥的進(jìn)展[6-7,23]。Nakagawa等[24]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中HOTAIR的表達(dá)水平與腫瘤的大小、分化程度及分期呈正相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在HCC827GR耐藥細(xì)胞及吉非替尼耐藥患者血清中表達(dá)均增高，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOTAIR后，HCC827GR細(xì)胞的增殖能力下降，凋亡率升高，并可引起G0期/G1期細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)能夠使HCC827GR細(xì)胞恢復(fù)對(duì)吉非替尼的敏感性，提示HOTAIR可能參與介導(dǎo)了NSCLC的吉非替尼耐藥。既往已有多項(xiàng)研究提示HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌、喉部鱗癌及乳腺癌中可通過靶向調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Ma等[25]發(fā)現(xiàn)HOTAIR能夠和miR-130a結(jié)合，通過下調(diào)miR-130a導(dǎo)致PTEN等基因下調(diào)，進(jìn)而激活A(yù)KT信號(hào)通路影響腫瘤的惡性表型。我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到HOTARI可作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）與miR-526b-3p、miR-519d-3p及miR106b-5p相互作用，形成ceRNA的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，而PTEN為miR-526b-3p、miR-519d-3p及miR106b-5p的下游靶基因，提示高表達(dá)HOTAIR可導(dǎo)致miRNA對(duì)PTEN的抑制力減弱，這與既往多項(xiàng)研究結(jié)果不符，考慮因數(shù)據(jù)庫(kù)納入樣本量不足及疾病種類不同而此造成偏差。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOTAIR后，HCC827GR細(xì)胞中PTEN表達(dá)升高，而PI3K及AKT的表達(dá)則較前下降，同時(shí)我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肺腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)，通過生存分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者總生存與PTEN表達(dá)呈正相關(guān)，而與HOTAIR表達(dá)則呈負(fù)相關(guān)，這與我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。因此我們推測(cè)，HOTAIR可調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路，通過負(fù)反饋?zhàn)饔糜赑TEN，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，下調(diào)HOTAIR表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)HCC827GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。

圖 5 下調(diào)HOTAIR促進(jìn)HCC827GR細(xì)胞凋亡Fig 5 Down-regulation of HOTAIR promotes the apoptosis of HCC827GR. *P＜0.05

圖 6 下調(diào)HOTAIR抑制HCC827GR細(xì)胞增殖（P＜0.05）Fig 6 Down-regulation of HOTAIR decreases the cell proliferation ability of HCC827GR (P＜0.05)

本研究首次證明了HOTAIR與HCC827細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥之間的關(guān)系及其機(jī)制，提示HOTAIR的表達(dá)可有助于判斷NSCLC患者對(duì)EGFR-TKIs類藥物的治療反應(yīng)，并為NSCLC靶向治療耐藥后的選擇提供了新的方向。

圖 7 吉非替尼耐藥的NSCLC患者血清中HOTAIR表達(dá)升高（P＜0.05）Fig 7 The expression of HOTAIR increased in the serum of NSCLC patients with gefitinib resis-tance (P＜0.05)

圖 8 PTEN(A)及HOTAIR(B)表達(dá)與肺腺癌患者的生存的相關(guān)性Fig 8 Correlation between the expression of PTEN(A) or HOTAIR(B) and the survival of patients with lung adenocarcinoma

Author contributions

Zhai Y, Li LN and Chen Q conceived and designed the study. Zhai Y and Chen Q performed the experiments. Wang YZ and Li X analyzed the data. Zhai Y and Li LN contributed analysis tools. Zhai Y, Li LN and Chen Q provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.