二代測序技術(shù)在NSCLC中的臨床應(yīng)用中國專家共識（2020版）

中國臨床腫瘤學(xué)會非小細(xì)胞肺癌專家委員會

1 引言

肺癌是目前全球最常見、致死率最高的惡性腫瘤[1]。2018年全球肺癌新發(fā)病例近209.4萬例，占所有惡性腫瘤的11.6%，死亡病例176.1萬例，占所有惡性腫瘤的18.4%[1]。全國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)[2]顯示，2014年我國新發(fā)肺癌患者數(shù)為78.1萬，死亡數(shù)達(dá)到62.6萬，居所有惡性腫瘤發(fā)病和死亡人數(shù)首位。17個(gè)癌癥注冊中心的數(shù)據(jù)[3]分析顯示，我國肺癌患者的年齡標(biāo)化5年相對生存率由2003年-2005年的16.1%僅增加至2012年-2015年的19.7%，仍不樂觀。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見的組織學(xué)類型，在肺癌病例中占比超過80%[4]。

隨著對疾病認(rèn)識的不斷加深，腫瘤的治療模式也在發(fā)生變革，個(gè)體化精準(zhǔn)治療模式逐漸成為主流。在NSCLC領(lǐng)域，隨著基因檢測技術(shù)的進(jìn)步和一系列新藥臨床研究的突破，近10年間新發(fā)現(xiàn)的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因不斷增多，推動(dòng)了NSCLC靶向治療藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用。

近年來興起的免疫治療是腫瘤治療領(lǐng)域的革命性突破。NSCLC的免疫治療研發(fā)和應(yīng)用速度進(jìn)步顯著，目前已有多個(gè)針對NSCLC患者的免疫治療方案獲批。但如何篩選出可從免疫治療中獲益的人群，仍是該療法在臨床應(yīng)用中的一大挑戰(zhàn)。研究[5]表明，全面的分子生物學(xué)檢測信息可為肺癌患者免疫治療的方案選擇、預(yù)后判斷，以及為臨床試驗(yàn)入組提供依據(jù)。

在此背景下，傳統(tǒng)基因檢測方法因基因覆蓋有限，存在漏檢的可能性，以及因組織樣本耗竭而影響后續(xù)檢測等方面的缺陷，已不能充分滿足目前的臨床需求。因此全面的腫瘤相關(guān)基因檢測方法則成為提升NSCLC患者治療效果及預(yù)后的有效手段。中國臨床腫瘤學(xué)會（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）NSCLC診療指南也提出應(yīng)采用經(jīng)過驗(yàn)證的檢測方法同時(shí)檢測多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因[6]。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）NSCLC指南則強(qiáng)烈支持通過全面分子測序的結(jié)果，指導(dǎo)臨床治療方案的確定，或納入相關(guān)臨床試驗(yàn)中。其他多個(gè)肺癌診療指南[6-8]也提出了類似的建議。

二代基因測序（next generation sequencing, NGS）又稱為高通量測序，該技術(shù)能夠同時(shí)對上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了高通量測序的目標(biāo)。目前國外已發(fā)表了多個(gè)NGS檢測技術(shù)指南，其中頗具影響力的包括EuroGentest和歐盟人類遺傳學(xué)會在2015年聯(lián)合發(fā)布的《二代測序診斷指南》[9]；美國分子病理學(xué)會（Association for Molecular Pathology, AMP）和美國病理學(xué)家協(xié)會（College of American Pathologists, CAP）在2017年聯(lián)合發(fā)布的《基于二代測序的腫瘤panels驗(yàn)證指南》[10]。我國近年來也發(fā)表了多個(gè)NGS專家共識，包括2017年中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會和中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會聯(lián)合發(fā)布的《臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室二代基因測序檢測專家共識》[11]；2018年陸續(xù)發(fā)表了由國內(nèi)多名專家和機(jī)構(gòu)聯(lián)合撰寫的《臨床基因檢測報(bào)告規(guī)范與基因檢測行業(yè)共識探討》[12]、中華醫(yī)學(xué)會制訂的《二代測序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用專家共識》[13]，以及中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會、中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會聯(lián)合制訂的《二代測序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國專家共識（2018年版）》[14]等。

現(xiàn)有的這些NGS指南通常側(cè)重檢驗(yàn)科室的技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，尚缺乏可指導(dǎo)NGS檢測在實(shí)體瘤臨床診療路徑中應(yīng)用的指南或共識，然而我國NSCLC患者數(shù)量龐大，精準(zhǔn)治療藥物的可及性高，全面而準(zhǔn)確的腫瘤基因診斷結(jié)果已經(jīng)成為肺癌醫(yī)師臨床診療的剛需。因此，我們邀請行業(yè)內(nèi)資深專家共同討論并撰寫了本共識，旨在為我國NSCLC臨床診療規(guī)范使用NGS這一新型基因檢測技術(shù)提供指引。

2 NGS檢測的適用人群

2.1 常規(guī)推薦進(jìn)行NGS檢測的NSCLC患者當(dāng)患者確診為晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC后，就需要考慮進(jìn)行分子病理檢測，以指導(dǎo)后續(xù)治療和判斷預(yù)后?；谂R床研究中報(bào)道的分子靶向藥物和免疫藥物治療效果，CSCO NSCLC診療指南（2020）推薦對病理學(xué)診斷為非鱗癌的肺癌患者組織標(biāo)本進(jìn)行分子標(biāo)志物檢測[6]。

針對肺鱗癌患者，目前尚無明確的基因檢測位點(diǎn)和獲批的分子靶向藥物，也無臨床證據(jù)支持對單純肺鱗癌患者常規(guī)進(jìn)行某個(gè)基因變異的檢測。雖然單純肺鱗癌患者中有4%的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變率[15]，但尚無證據(jù)支持肺鱗癌患者使用靶向EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TK I）顯著獲益，因此不推薦對單純肺鱗癌患者進(jìn)行EGFR基因檢測。而另一方面，研究[16,17]提示病理類型是含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合鱗癌的NSCLC患者也可能攜帶敏感型突變，可從靶向治療中獲益。一些臨床特征也與敏感型突變相關(guān)，如較年輕、不吸煙或少吸煙（少于100支/年）[7]。因此CSCO NSCLC診療指南（2020）也建議對不吸煙、經(jīng)小標(biāo)本活檢診斷為肺鱗癌或混合腺癌成分的患者進(jìn)行驅(qū)動(dòng)基因檢測[6]。

共識 1：推薦所有病理診斷為肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者常規(guī)進(jìn)行基因檢測?！綢級推薦】

對經(jīng)小標(biāo)本活檢診斷為含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鱗癌，以及年輕或不吸煙/少吸煙肺鱗癌患者，也推薦進(jìn)行基因檢測?！綢I級推薦】

2.2 NGS和傳統(tǒng)檢測方法的比較 隨著對NSCLC發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識的逐漸深入，在研的新靶點(diǎn)和治療方案也不斷增多，加上臨床診療需求的不斷拓展，對NSCLC的腫瘤基因檢測技術(shù)提出了更高的要求[13]。

目前，在我國NSC L C的臨床診療過程中，篩選分子標(biāo)志物所使用的檢測方法仍以免疫組織化學(xué)檢測（immunohistochemistry, IHC）、熒光原位雜交檢測（fluorescencein situhybridization, FISH）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）等傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)為主。

IHC是利用抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，檢測組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中特定蛋白質(zhì)表達(dá)量的技術(shù)，與其他技術(shù)檢測DNA變異有所不同。IHC技術(shù)成熟，成本低廉，但僅能檢測蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變，并且由于其依賴于人工判讀，對于1+/2+的弱陽性結(jié)果不能直接確診，需要使用其他方法再次檢測進(jìn)行驗(yàn)證。

FISH是通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察并分析基因擴(kuò)增或融合的一種分子遺傳學(xué)分析技術(shù)。FISH是臨床檢測基因擴(kuò)增和融合的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其操作復(fù)雜，依賴人工判讀，因此對診斷醫(yī)生要求較高。同時(shí)，由于FISH需要利用預(yù)先設(shè)定好的探針進(jìn)行雜交，僅能檢測少數(shù)已知的融合基因，無法確定和區(qū)分不同的融合配體基因，更無法發(fā)現(xiàn)新伴侶的融合基因。

PCR和NGS都是檢測DNA變異的技術(shù)。臨床上最為廣泛應(yīng)用的是擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）-PCR技術(shù)。ARMS-PCR檢測具有單次檢測DNA使用量少，靈敏度高（0.1%-0.001%），操作簡單，檢測周期短（幾小時(shí)內(nèi)可出具檢測報(bào)告），單個(gè)基因/位點(diǎn)的檢測費(fèi)用較低，可以同時(shí)檢測數(shù)十個(gè)已知的基因點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、部分明確的融合基因等特點(diǎn)。與ARMS-PCR相比，NGS檢測存在的缺點(diǎn)包括：所需DNA樣本量較高，操作流程復(fù)雜（包含雜交捕獲、建庫、測序、數(shù)據(jù)分析、變異注釋等流程），對于操作人員及操作環(huán)境的要求高，檢測周期長（針對涵蓋基因數(shù)量不同的檢測panel，需3 d-10 d出報(bào)告），費(fèi)用相對較高等；但NGS檢測技術(shù)具有其不可替代的優(yōu)勢：可以同時(shí)涵蓋數(shù)十至數(shù)百個(gè)基因，檢測所有位點(diǎn)突變、未知伴侶的融合基因、拷貝數(shù)變異等多種變異類型[18]，同時(shí)可評估腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI）等免疫治療相關(guān)分子標(biāo)志物。

傳統(tǒng)基因檢測方法因臨床可及性高和單次檢測成本較低而在臨床應(yīng)用廣泛。但與NGS相比，傳統(tǒng)檢測技術(shù)也存在一些技術(shù)缺陷，主要體現(xiàn)在：①通量低，一次只能篩查出有限數(shù)量的基因變異，會遺漏某些類型的基因變異；②不能檢測未知基因變異；③不能同時(shí)提供TMB和MSI數(shù)據(jù)；④耗竭樣本，影響后續(xù)進(jìn)一步檢測。尤為重要的是，這類檢測方法可能漏檢少見或罕見的突變，導(dǎo)致“假陰性”結(jié)果，使患者失去精準(zhǔn)治療的機(jī)會。例如，PCR僅限于分析DNA的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、少數(shù)常見亞型的融合基因檢測[23]，ARMS-PCR無法有效檢出EGFR19del某些罕見亞型[19]；ARMS-PCR同樣無法有效檢出酪氨酸蛋白激酶MET（c-mesenchymal-epithelial transition factor,C-MET）14號外顯子跳躍突變等罕見基因變異[20]；IHC可檢測蛋白表達(dá)，但無法檢測任何已知或未知的突變[21]；FISH可檢測拷貝數(shù)變異和重排（融合），但無法檢測堿基替換或插入/缺失[22]。

相比傳統(tǒng)基因檢測方法，NGS檢測有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。NGS可以一次性、特定時(shí)間（約10個(gè)工作日）產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域（從數(shù)個(gè)基因到數(shù)百個(gè)基因以至全外顯子組或全基因組）的高通量測序數(shù)據(jù)[13]，在臨床診療中有重要的應(yīng)用價(jià)值：①NGS檢測可同時(shí)檢出多個(gè)基因的點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異、基因重排四種變異形式，提供全面的基因突變數(shù)據(jù)，為初診晚期NSCLC患者提供精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)，包括正確選擇靶向治療方案、協(xié)助判斷是否可使用免疫治療方案、指導(dǎo)臨床試驗(yàn)入組、提供療效預(yù)測信息等[24]；②避免由于單個(gè)基因序貫檢測帶來的樣本耗竭和檢測時(shí)間延長，更加快速地為患者治療方案選擇提供依據(jù)；③當(dāng)患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)再次進(jìn)行全面的基因檢測，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的耐藥機(jī)制，并且全面的基因變異檢測信息可以為下一步治療方案的選擇提供依據(jù)[24]；④盡管NGS多基因同時(shí)分析的總成本較高，但對比傳統(tǒng)檢測方法，單個(gè)基因單個(gè)位點(diǎn)的平均檢測費(fèi)用已大大下降。

由于NGS技術(shù)可以同時(shí)檢測多個(gè)基因所有變異類型的特點(diǎn)，因此對于傳統(tǒng)檢測方式陰性的患者樣本建議使用NGS復(fù)檢。一項(xiàng)針對晚期NSCLC患者的回顧性研究[25]數(shù)據(jù)顯示，83%的患者攜帶潛在可用藥的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變，其中50%為指南推薦的肺癌可用藥基因變異；在既往傳統(tǒng)單基因檢測提示EGFR和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）變異陰性的晚期NSCLC患者中，經(jīng)NGS檢測發(fā)現(xiàn)17.4%的患者攜帶至少一個(gè)EGFR或ALK基因變異。另一項(xiàng)研究[26]發(fā)現(xiàn)，基于NGS檢測篩選出的47例ALK重排陽性腫瘤樣本（41例EML4-ALK融合，6例其他融合伴侶），對有既往FISH檢測結(jié)果的31例腫瘤樣本進(jìn)行分析，顯示有11例（35%）患者在既往FISH檢測中為假陰性。這11例患者中有9例基于NGS檢測結(jié)果接受了克唑替尼治療并實(shí)現(xiàn)臨床獲益。紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究[27]中，研究者對非NGS技術(shù)檢測顯示基因變異陰性的31例肺腺癌患者的組織樣本使用FoundationOne?CDx重新進(jìn)行NGS分析，結(jié)果有65%的樣本檢出存在可用藥的基因變異，部分患者基于檢測結(jié)果接受了已獲批或NCCN指南推薦的靶向藥物治療，并達(dá)到臨床獲益。一項(xiàng)韓國的研究[28]對51例采用非NGS檢測提示EGFR/KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene）/ALK陰性的肺腺癌樣本分析后發(fā)現(xiàn)，31%的患者存在NCCN指南推薦的可用藥靶點(diǎn)基因變異。由此可見，非NGS技術(shù)檢測驅(qū)動(dòng)基因變異存在“假陰性”的可能性，因此對于傳統(tǒng)檢測方式陰性的患者樣本建議使用NGS復(fù)檢。

共識2：針對敏感型突變發(fā)生率高的NSCLC患者（見“共識1”），常規(guī)基因檢測結(jié)果為陰性時(shí)，建議使用中國國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration,NMPA）或美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)檢?！綢II級推薦】

3 晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)NSCLC患者首次進(jìn)行基因檢測的共識意見

在過去20余年間，晚期NSCLC的臨床治療從只有一種針對EGFR突變的靶向治療方案，發(fā)展至今已有針對不同驅(qū)動(dòng)基因變異的多種分子靶向治療方案。分子靶向治療已成為驅(qū)動(dòng)基因變異陽性肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療策略之一。另一方面，以程序性死亡受體1（programmed death-1,PD-1）/PD配體1（PD ligand 1, PD-L1）抑制劑等免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的新型腫瘤免疫療法近年來在晚期惡性腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展迅速，已成為部分驅(qū)動(dòng)基因陰性的晚期NSCLC患者的重要治療方案之一。與此同時(shí)，基于分子生物學(xué)探索分子靶向治療和免疫治療生物標(biāo)志物，篩選治療優(yōu)勢人群成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外的肺癌診療指南[5,6]也一致推薦對NSCLC患者進(jìn)行廣泛的分子標(biāo)記物檢測，并制定了基于檢測結(jié)果的個(gè)體化精準(zhǔn)診療流程。

3.1 晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)NSCLC患者首次進(jìn)行基因檢測的目標(biāo)范圍推薦 隨著越來越多針對NSCLC患者的分子靶向和免疫治療方案的獲批，國內(nèi)外NSCLC診療指南推薦檢測的NSCLC驅(qū)動(dòng)基因和生物標(biāo)志物也不斷增加。國內(nèi)外NSCLC診療指南[5,6]對不可手術(shù)的III期及IV期NSCLC患者推薦的分子標(biāo)志物檢測內(nèi)容和相關(guān)個(gè)體化治療策略見表1-表3。

3.2 NSCLC常見驅(qū)動(dòng)基因 考慮到中國NSCLC患者特有的基因變異頻率、藥物在中國的獲批適應(yīng)證及藥物可及性，CSCO NSCLC診療指南（2020）明確指出對不可手術(shù)的晚期NSCLC患者推薦的首次分子標(biāo)志物檢測內(nèi)容必須包含EGFR、ALK、ROS1（ROS proto-oncogene 1）三個(gè)基因（表1）。EGFR、ALK、ROS1常見變異涵蓋多個(gè)位點(diǎn)及多種變異類型，本共識推薦使用NMPA批準(zhǔn)的檢測產(chǎn)品，無論使用PCR、FISH或NGS方法，建議同時(shí)檢測EGFR突變、ALK融合和ROS1融合三種形式的基因變異。

表 1 國內(nèi)外肺癌診療指南對不可手術(shù)Ⅲ期及Ⅳ期患者推薦的首次分子標(biāo)志物檢測內(nèi)容Tab 1 First-time molecular biomarker testing for advanced NSCLC patients recommended by CSCO and NCCN NSCLC guidelines

表 2 2020版CSCO NSCLC診療指南（2020）對分子標(biāo)志物檢測結(jié)果陽性的不可手術(shù)Ⅲ期及Ⅳ期患者推薦的一線分子靶向/免疫治療方案[6]Tab 2 First-line therapy for molecular biomarker positive advanced NSCLC patients recommended by CSCO NSCLC guideline[6]

EGFR：EGFR突變是NSCLC驅(qū)動(dòng)基因研究中最早發(fā)現(xiàn)的基因突變，也是NSCLC中最常見的驅(qū)動(dòng)基因變異。東亞患者中EGFR突變的發(fā)生率高達(dá)46.7%，尤其見于腺癌（54.1%）和女性（61.8%）患者[29]。該基因的常見突變位點(diǎn)發(fā)生在18號-21號外顯子上，其中最常見的是19號外顯子缺失突變（19del）以及21號外顯子L858點(diǎn)突變（L858R），這兩種突變占比約為90%，均為EGFR-TKI敏感型突變[5]。分子生物學(xué)研究揭示了一些EGFR少見突變（發(fā)生率約10%）與EGFR-TKI治療敏感相關(guān)，如19號外顯子插入、L861Q、G719X、S768I、20號外顯子插入突變A763_Y764insFQEA；研究[5]還發(fā)現(xiàn)了少見的耐藥突變，如20號外顯子其他插入類型（除A763_Y764insFQEA）和T790M（對三代TKI敏感）。一項(xiàng)基于FoundationOne?CDx檢測結(jié)果[30]的數(shù)據(jù)分析，描述了NSCLC中罕見EGFR突變亞型的分布特征，發(fā)現(xiàn)在非L858R/del19的EGFR突變中，20號外顯子插入突變和G719X突變最為常見。

A LK：A LK基因融合在NSCLC中的發(fā)生率約為7%，EML4是最常見的A LK融合伴侶，占A LK重排的90%-95%[31]。EML4-ALK又分為多個(gè)亞型，其中V1型（E13;A20）和V3型（E6; A20）占比最高，均為32%左右[31]，其他EML4-ALK融合亞型則較為少見（占比均不足10%）[31]。除EML4這一最常見的融合伴侶外，研究[32]還發(fā)現(xiàn)KIF5B、TFG、KLC1、SOCS5、HIP1、TPR、BIRC6等多種罕見的ALK融合伴侶，這些基因變異可能與腫瘤進(jìn)展和治療相關(guān)。不同融合亞型或不同治療方案[33]治療后產(chǎn)生的耐藥突變也存在差異[31]。

ROS1：ROS1融合基因在NSCLC中的發(fā)生率約為2%[5]，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在32號-36號外顯子[34]，最常見的ROS1融合伴侶是CD74、SLC34A2、CCDC6和FIG[5]。近年來發(fā)現(xiàn)了更多的新型ROS1融合伴侶，如基于FoundationOne?CDx檢出的罕見的新型TPD52L1-ROS1融合[35]和TMEM106B-ROS1融合[36]。

共識3：針對晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次檢測建議采用NMPA批準(zhǔn)的檢測產(chǎn)品，檢測至少包括NSCLC常見驅(qū)動(dòng)基因: EGFR突變（應(yīng)涵蓋18號、19號、20號、21號外顯子），以及ALK融合、ROS1融合?！綢級推薦】

3.3 NSCLC少見驅(qū)動(dòng)基因 除了上述常見EGFR突變、ALK融合、ROS1融合外，雖然BRAF（B-Raf proto-oncogene）、KR AS、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶（neurotrophic tyrosine receptor kinase,NTRK）1/2/3、MET、ERBB2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2）和RET（ret protooncogene）等基因在NSCLC中的變異頻率相對較低，但由于其已有對應(yīng)獲批或在研的靶向治療藥物，成為NSCLC患者潛在的可靶向治療基因。雖然目前國內(nèi)相關(guān)靶向藥物的可及性較低，但具有前瞻性臨床應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)重視對這些靶點(diǎn)的檢出。2020版CSCO NSCLC診療指南也推薦在廣泛分子標(biāo)志物檢測中納入這些少見驅(qū)動(dòng)基因[6]?？紤]到上述少見肺癌驅(qū)動(dòng)基因并非全部含有NMPA批準(zhǔn)的傳統(tǒng)檢測產(chǎn)品（IHC、FISH、PCR等），并且NMPA批準(zhǔn)的NGS檢測產(chǎn)品（國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站https://www.nmpa.gov.cn/）也無法涵蓋上述全部基因的變異類型，本共識建議結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，優(yōu)先使用NMPA批準(zhǔn)的傳統(tǒng)或NGS檢測產(chǎn)品，在NMPA批準(zhǔn)的檢測產(chǎn)品無法滿足臨床需求的情況下可以考慮使用FDA批準(zhǔn)的NGS檢測產(chǎn)品進(jìn)行檢測，建議檢測包括BRAFV600E、KRAS（如G12C等）、NTRK1/2/3融合、MET14號外顯子跳躍突變和MET擴(kuò)增、ERBB220號外顯子插入、RET融合等少見驅(qū)動(dòng)基因。

BRAF：2%-4%的NSCLC患者攜帶BRAF突變[37]。BRAF突變分為3種類型，I類（BRAFV600E/K/D/R/M）突變是最常見于NSCLC的BRAF突變，NCCN指南[5]推薦的靶向藥物為達(dá)拉菲尼和曲美替尼。II類、III類BRAF突變患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，共突變發(fā)生率高，暫無確定的靶向治療方案，并且患者預(yù)后通常較差[37]。

K R AS：K R AS是NSCLC的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)基因，10.1%的東亞NSCLC患者攜帶這一突變[29]。KRAS突變型NSCLC患者EGFR-TKI療效不佳，預(yù)后較差[5]。由于KRAS突變類型多，下游信號通路復(fù)雜，既往的靶向藥物研究均宣告失敗，目前并無推薦的靶向藥物[6]。KRASG12C是一個(gè)潛在可用藥靶點(diǎn)。NSCLC患者中約20%的KRAS突變?yōu)镵RASG12C突變。目前針對這一突變類型的靶向藥物雖然尚未獲批，但兩個(gè)KRASG12C抑制劑——AMG510[38]和MRTX849[39]已在臨床前和初期臨床試驗(yàn)中顯示出良好的治療效果。從2019年ASCO大會上發(fā)布的AMG510 I期臨床研究數(shù)據(jù)來看，這一KRASG12C不可逆抑制劑在NSCLC患者中的療效和安全性均表現(xiàn)良好[40]。

表 3 NCCN指南中對于其他相對少見基因變異型NSCLC患者推薦的靶向/免疫治療方案（在我國相關(guān)藥物適應(yīng)證尚未獲批）[5]Tab 3 Appropriate treatment options for other molecular biomarker positive patients recommended by NCCN NSCLC guidelines[5]

NTRK：NTRK基因包括NTRK1/2/3三種亞型，分別編碼TRK A/B/C蛋白。NTRK基因發(fā)生融合激活后，將引發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。雖然NTR K融合在肺癌患者中的發(fā)生率較低（＜1%-5%）[41]，但基于NGS檢出的NTR K融合肺癌患者在兩個(gè)泛TRK抑制劑——恩曲替尼（Enctrectinib）[42]和拉羅替尼（Larotrectinib）[43]的關(guān)鍵籃子研究（basket trial）中均獲得顯著臨床獲益?；谶@兩項(xiàng)研究結(jié)果，CSCO NSCLC診療指南（2020）將這兩個(gè)NTRK抑制劑推薦用于治療NTRK基因融合陽性的NSCLC患者[6]。

MET：c-MET是NSCLC的重要驅(qū)動(dòng)基因，c-MET通路異常激活主要包括MET14號外顯子跳躍突變、MET擴(kuò)增和MET蛋白過表達(dá)3種類型。MET14號外顯子跳躍突變在肺腺癌中的發(fā)生率約為3%，是重要的原發(fā)致癌驅(qū)動(dòng)基因變異[44]。MET擴(kuò)增在NSCLC中的發(fā)生率為3%-7%[45]，是三代EGFR-TKI的重要耐藥機(jī)制之一[46]?；谂R床研究[47,48]，NCCN指南推薦克唑替尼用于治療MET高水平擴(kuò)增或MET14號外顯子跳躍突變的NSCLC患者[5]。此外，已有多個(gè)靶向治療方案在臨床研究中顯示對MET擴(kuò)增NSCLC有治療活性[49-52]。針對MET14號外顯子跳躍突變晚期NSCLC患者的多個(gè)新藥也已處于臨床研究階段[53-55]。

ERBB2（HER2）：HER2突變在NSCLC中以酪氨酸激酶域的18號-21號外顯子突變較多，發(fā)生率約為2%-4%[56-58]。在臨床研究中顯示對HER2突變型NSCLC有治療活性的藥物包括曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物（Trastuzumab Emtansine,T-DM1）[59]、Trastuzumab Deruxtecan（T-DXd、DS-8021）[60]、吡咯替尼[61]、波奇替尼[62]、曲妥珠單抗[63]、阿法替尼[64]和Neratinib[65]等。曲妥珠單抗和阿法替尼單藥方案既往曾被推薦用于HER2突變陽性的NSCLC患者，但因?yàn)橹委熡行实?，證據(jù)級別較低而不再推薦。基于一項(xiàng)II期籃子研究結(jié)果[59]，NCCN指南目前推薦T-DM1用于治療HER2突變陽性的NSCLC患者[5]。

RET：RET融合在NSCLC中的發(fā)生率約為2%[66]，變異類型主要包括與KIF5B、TRIM33、CCDC6和NCOA4等基因發(fā)生融合，以及M918T等位點(diǎn)的點(diǎn)突變。NCCN指南目前推薦多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑卡博替尼和Vandetanib用于治療RET融合突變陽性NSCLC患者[5]。但從目前的數(shù)據(jù)來看，卡博替尼[67,68]和Vandetanib[69]對RET靶點(diǎn)的治療效果并不理想。正在開展的臨床研究中，阿來替尼[70]、多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑［侖伐替尼[71]、RXDX-105[72]、Pralsenitinib（BLU-667）[73]］、RET單靶點(diǎn)抑制劑Selpercatinib（LOXO-292）[74]的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)值得期待。

共識4：針對晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，如需獲得更多的潛在靶點(diǎn)信息，首次檢測建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的檢測產(chǎn)品，檢測包括BRAF V600E、KRAS（如G12C等）、NTRK1/2/3融合、MET 14號外顯子跳躍突變和MET擴(kuò)增、ERBB2 20號外顯子插入、RET融合等少見驅(qū)動(dòng)基因變異。【II級推薦】

3.4 NSCLC常見/少見驅(qū)動(dòng)基因的罕見變異形式 隨著NGS檢測技術(shù)在NSCLC臨床診療中應(yīng)用的普及，也推動(dòng)了NSCLC驅(qū)動(dòng)基因研究的迅猛發(fā)展，越來越多常見/少見驅(qū)動(dòng)基因的罕見變異形式被揭示與患者的臨床療效密切相關(guān)。腫瘤分子標(biāo)志物研究的目的是為了使越來越多的患者獲益于個(gè)體化治療。因此，即使攜帶罕見基因變異類型的NSCLC患者人群較少，且多為個(gè)案報(bào)告，但仍需重視其檢測，以增加更多患者獲得精準(zhǔn)治療的機(jī)會，同時(shí)也為肺癌新藥的研發(fā)提供證據(jù)支持。

EGFR激酶區(qū)串聯(lián)重復(fù)（kinase domain duplication,KDD）和融合：EGFRKDD在肺癌中發(fā)生率約為0.07%，對阿法替尼、?？颂婺岬菶GFR-TKI治療敏感[75,76]；EGFR融合在肺癌中的發(fā)生率為0.08%，一系列EGFR融合變異（已報(bào)告的有EGFR-RAD51、EGFR-PURB、EGFR-SEPT14、EGFR-TNS3、EGFR-ZCCHC6、LINCO1446-EGFR）可以從厄洛替尼、阿法替尼、?？颂婺嶂委熤蝎@益[77]。

BRAFKDD和融合：NSCLC中BRAFKDD和BRAF融合的發(fā)生率不到0.5%[78,79]。個(gè)案報(bào)告[79]顯示，攜帶BRAFKDD的NSCLC患者接受BRAF-TKI治療有效。其他癌種的個(gè)案報(bào)告提示，針對不同BRAF融合基因使用個(gè)體化靶向治療方案可使患者獲益[80,81]。

METKDD和融合：METKDD和融合在中國NSCLC患者中的發(fā)生率分別為0.09%[79]和0.04%[82]。攜帶METKDD的NSCLC患者對MET-TKI治療有反應(yīng)[80]。國內(nèi)外多個(gè)個(gè)案報(bào)告[76,82-84]顯示，攜帶MET融合的NSCLC患者使用克唑替尼治療有效。

ERBB2（HER2）融合：分析數(shù)據(jù)顯示，中國NSCLC患者中ERBB2融合的發(fā)生率為0.29%。部分患者使用阿法替尼治療有效[85]。

共識5：共識3和共識4中基因檢測均為陰性的NSCLC患者再次檢測時(shí)，建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品，檢測包含EGFR罕見變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、BRAF罕見變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、MET罕見變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、ERBB2融合等罕見變異形式?！綢II級推薦】

3.5 免疫治療療效及預(yù)后生物標(biāo)志物 近年來，以PD-1/PD-L1抑制劑等免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫療法進(jìn)入臨床應(yīng)用，是肺癌治療領(lǐng)域的一大里程碑事件。免疫療法很大程度地改善了晚期NSCLC患者的生存預(yù)后，且療效持久。但免疫療法在未經(jīng)選擇的人群中有效率偏低，如PD-1/PD-L1抑制劑單藥用于NSCLC的應(yīng)答率僅為25%[86]。因此尋找合適的分子標(biāo)志物以篩選優(yōu)勢人群，是實(shí)現(xiàn)免疫治療精準(zhǔn)化的關(guān)鍵。

回顧性分析[87]提示，攜帶明確驅(qū)動(dòng)基因變異的NSCLC患者傾向于表現(xiàn)為冷腫瘤的免疫微環(huán)境特征，即免疫治療效果并不理想。CSCO NSCLC診療指南（2020）也將肺癌免疫治療的人群限制為無驅(qū)動(dòng)基因變異的患者[6]。IASLC（International Association for the Study of Lung Cancer）專家共識則特別強(qiáng)調(diào)，在存在可用藥致癌驅(qū)動(dòng)基因變異的腫瘤中，必須禁止前期使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑，對于晚期患者，在沒有獲得常規(guī)基因組信息（EGFR、ALK、ROS1和BRAF）的情況下，不應(yīng)該使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑[87]。

目前進(jìn)入臨床實(shí)踐的免疫治療生物標(biāo)志物有PD-L1高表達(dá)、錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（mismatch repairdeficient, dMMR）/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（high-frequency microsatellite instability, MSI-H），以及高腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden-high, TMB-H）。PD-L1高表達(dá)（≥50%）是目前NSCLC一線免疫單藥治療唯一獲批的分子標(biāo)志物。但由于腫瘤異質(zhì)性以及缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測方法，加之免疫組化檢測方法本身的檢測敏感性差異問題，PD-L1檢測目前僅在部分腫瘤適應(yīng)證中作為使用特定藥物的臨床分子標(biāo)志物[87]。dMMR/MSI-H是獲FDA批準(zhǔn)、不限組織學(xué)類型的免疫治療生物標(biāo)志物[88]。FDA也已批準(zhǔn)了針對MSI-H腫瘤的免疫治療方案[88]。但由于dMMR/MSI-H在肺癌患者中的發(fā)生頻率較低，其在肺癌免疫治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值仍需更多研究探索。

TMB作為預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在標(biāo)志物已逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用。已有研究表明，組織腫瘤突變負(fù)荷高（tissue TMB, tTMB）與NSCLC免疫治療總體生存率（overall survival, OS）獲益有相關(guān)性[89,90]，結(jié)合PD-L1和TMB可以更好地預(yù)測NSCLC患者的免疫治療療效[91]?；趦身?xiàng)III期研究結(jié)果[92,93]，NCCN指南推薦TMB作為新的生物標(biāo)志物，用于篩選納武利尤單抗聯(lián)合伊匹單抗方案和納武利尤單抗單藥治療方案的優(yōu)勢人群[5]?；贗I期KEYNOTE-158研究數(shù)據(jù)，美國FDA近期已批準(zhǔn)帕博利珠單抗用于TMB-H（≥10個(gè)突變/兆堿基）、既往治療后病情進(jìn)展且無滿意替代治療方案的不可手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者[94]。此外，為克服組織樣本檢測的局限性，血液TMB（blood TMB, bTMB）檢測的應(yīng)用逐漸廣泛，從POPLAR和OAK研究[95]，再到B-FIRST[96]、BFAST研究，都顯示出bTMB預(yù)測免疫治療療效的潛力。但由于多家基因檢測公司檢測TMB時(shí)使用的panel所涵蓋的基因不同，探針覆蓋的基因位置和范圍不同（基因全長覆蓋或熱點(diǎn)區(qū)域覆蓋），設(shè)定的cut-off值也不同，所以TMB檢測目前仍無法標(biāo)準(zhǔn)化，從而限制了其廣泛應(yīng)用于臨床。

此外，已有一些研究發(fā)現(xiàn)，某些基因變異與免疫治療效果密切相關(guān)，如KRAS突變和TP53突變的腫瘤可能有更好的免疫療效[97]；抑癌基因STK11缺失突變則可能造成免疫治療的療效不佳[98]。一系列早期研究中顯示，一些罕見基因突變可能與腫瘤免疫原性升高有關(guān)，如MUC16突變、MET14號外顯子突變、BRCA1/2突變、POLE突變、POLD1突變和MSH2突變[99]，但其臨床效用仍需大樣本的臨床研究進(jìn)一步探索。研究[100,101]發(fā)現(xiàn)，有9%-29%的患者在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中出現(xiàn)了超進(jìn)展（hyperprogression, HP）現(xiàn)象，這部分患者一般預(yù)后極差，中位生存時(shí)間僅2個(gè)月-5個(gè)月。目前發(fā)現(xiàn)MDM2/MDM4擴(kuò)增、EGFR擴(kuò)增和位于11q13位點(diǎn)的一些基因如CCND1、FGF3、FGF4和FGF19等擴(kuò)增與HP存在相關(guān)性，推測這些基因變異可能是預(yù)測HP的標(biāo)志物[102]。一系列與免疫治療預(yù)后相關(guān)的新興生物標(biāo)志物也在持續(xù)探索中，如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes, TIL）、DNA損傷修復(fù)（DNA damage repair, DDR）通路基因變異、外泌體中特定蛋白的檢測、DNA甲基化、腸道菌群等。

共識6：結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，如需獲取免疫治療相關(guān)的分子標(biāo)志物信息，晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品進(jìn)行檢測，檢測包含MSI、tTMB、免疫治療正負(fù)向相關(guān)基因和免疫治療超進(jìn)展相關(guān)基因在內(nèi)的免疫治療相關(guān)分子標(biāo)志物。【III級推薦】

3.6 NGS檢測平臺的選擇 為了協(xié)助臨床合理使用不斷革新的治療策略，理想的NGS檢測平臺應(yīng)能夠：①單次檢測就能發(fā)現(xiàn)與臨床治療相關(guān)基因的所有類型變異，包括點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異、基因重排；②覆蓋的檢測范圍廣泛，可提供TMB、MSI等重要免疫治療分子標(biāo)志物；③所需樣本少；④檢測周期短。為了保證臨床實(shí)踐的準(zhǔn)確性，NGS檢測結(jié)果必須保證檢測流程的穩(wěn)定，包含目標(biāo)區(qū)域富集方法、測序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等一系列可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素[13]。

NGS 技術(shù)包括全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）、全外顯子組測序（whole exome sequencing, WES）、熱點(diǎn)基因變異的NGS小/大panel檢測以及全面基因組（comprehensive genomic profiling, CGP）檢測等。由于WGS和WES檢測覆蓋的基因范圍過于廣泛，納入了大量與腫瘤不相關(guān)的基因，引起檢測周期延長、成本上升，進(jìn)而引起檢測深度不足而造成的敏感性下降，加上無法或極少涵蓋與腫瘤發(fā)生發(fā)展或治療密切相關(guān)的融合基因內(nèi)含子區(qū)域，其應(yīng)用偏向于科研，無法在臨床廣泛應(yīng)用[103]。

目前國內(nèi)外獲批用于NSCLC的NGS檢測方法有熱點(diǎn)基因變異NGS檢測和全面基因組CGP檢測兩種。腫瘤熱點(diǎn)基因變異NGS panel的檢測范圍一般僅局限于發(fā)生頻率較高的特定基因[104]，僅檢測少數(shù)目標(biāo)基因的特定區(qū)域（即已被證實(shí)有與高致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的區(qū)域）[105]，并且無法檢測所有的基因變異類型[19]。我國已獲批用于NSCLC患者檢測的NGS產(chǎn)品均為熱點(diǎn)基因檢測[106]。CGP檢測要求至少覆蓋300個(gè)以上與腫瘤用藥、預(yù)后密切相關(guān)基因的全外顯子區(qū)域；覆蓋臨床意義明確的熱點(diǎn)融合基因的內(nèi)含子區(qū)域；包含TMB、MSI檢測；并可以準(zhǔn)確評估所有基因的拷貝數(shù)變化（copy number variation, CNV）。

C G P 檢測目前已經(jīng)獲得F D A 批準(zhǔn)的包括FoundationOne?CDx和MSK-IMPACTTM。FoundationOne?CDx是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)NGS泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品，基于雜交捕獲技術(shù)，覆蓋包括309個(gè)基因的全部外顯子以及34個(gè)常見重排基因的特定內(nèi)含子，一次檢測即可提供324個(gè)腫瘤相關(guān)基因的四種變異信息，有效測序深度達(dá)到500X以上，可檢出腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的罕見變異形式，同時(shí)還能提供TMB和MSI數(shù)據(jù)[107]。FoundationOne?CDx是目前唯一一個(gè)經(jīng)過分析驗(yàn)證[108]和臨床驗(yàn)證[93,109,110]的泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品。MSK-IMPACTTM是第一個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的腫瘤基因組補(bǔ)充診斷產(chǎn)品，MSK-IMPACTTM同樣也是基于雜交捕獲技術(shù)，一次檢測可提供468個(gè)腫瘤相關(guān)基因的兩種基因變異類型（堿基替換和插入/缺失）。

FDA批準(zhǔn)上市應(yīng)用于臨床診斷尤其是伴隨診斷的檢測方法，對其分析驗(yàn)證及臨床驗(yàn)證兩方面均有嚴(yán)格要求[111]。分析驗(yàn)證主要驗(yàn)證檢測技術(shù)的方法學(xué)以確認(rèn)分析性能。CGP檢測由于其覆蓋范圍廣、分析過程復(fù)雜等特點(diǎn)，目前主要以突變類型區(qū)分或以臨床意義明確的關(guān)鍵基因或位點(diǎn)為代表，對細(xì)胞系和臨床樣本進(jìn)行檢測，與已經(jīng)獲批的PCR、FISH等產(chǎn)品的檢測結(jié)果進(jìn)行一致性分析，給出相應(yīng)的準(zhǔn)確性（包含敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值）和精確度（包括可重復(fù)性、可再現(xiàn)性、檢出下限）等方法學(xué)參數(shù)[112]。而基于突變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制，在方法學(xué)可靠的基礎(chǔ)上，更需要關(guān)鍵性的臨床驗(yàn)證來確定Cut-off值、臨床敏感性與特異性，從而進(jìn)一步保證檢測結(jié)果指導(dǎo)下的用藥能真正實(shí)現(xiàn)患者的臨床獲益[10]。對于一些發(fā)展較成熟的突變標(biāo)志物，例如EGFR基因突變，臨床驗(yàn)證常采用非劣效性測試進(jìn)行基因變異檢測一致性及相對應(yīng)藥物療效相關(guān)性的回顧性分析。而對于不斷涌現(xiàn)的新靶點(diǎn)標(biāo)志物的檢測，尤其是沒有對應(yīng)的PCR、FISH、IHC等傳統(tǒng)檢測方法獲批的分子標(biāo)志物，前瞻性臨床研究數(shù)據(jù)不可或缺。FoundationOne?CDx的TMB檢測正是基于其參與的多項(xiàng)II期/III期的免疫治療藥物臨床研究[92-94]的療效數(shù)據(jù)，成為目前唯一一個(gè)經(jīng)過分析驗(yàn)證[108]和臨床驗(yàn)證[106-108]的泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品。同樣，bTMB與Atezolizumab療效的相關(guān)性在通過對POPLAR和OAK試驗(yàn)的回顧性檢測得到初步臨床驗(yàn)證后，又在NSCLC患者中開展前瞻性的B-FIRST研究及前瞻性BFAST傘式研究來進(jìn)一步臨床驗(yàn)證[95,96]。

目前國內(nèi)尚無已經(jīng)獲批的CGP檢測Panel，但已有幾家國內(nèi)基因檢測公司向NMPA提交了腫瘤NGS檢測大Panel的注冊，相信經(jīng)過分析驗(yàn)證與臨床驗(yàn)證的CGP檢測Panel在中國獲批后，會為中國肺癌患者帶來更廣泛的臨床獲益。

考慮到藥物可及性等因素，晚期NSCLC患者的首次分子標(biāo)志物檢測建議使用NMPA或FDA批準(zhǔn)的檢測方法進(jìn)行。使用非NGS的檢測方法，可能會造成組織樣本耗竭進(jìn)而導(dǎo)致無法再進(jìn)行后續(xù)基因檢測，進(jìn)而使患者錯(cuò)失潛在的靶向治療機(jī)會。紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究發(fā)現(xiàn)[27]，在非NGS檢測提示驅(qū)動(dòng)基因變異陰性的NSCLC患者中，有34%的患者在組織耗竭的情況下不適合或拒絕再次穿刺活檢。而CGP可節(jié)省序貫單基因測序或熱點(diǎn)基因變異檢測可能帶來的樣本/時(shí)間/成本消耗[24]。由此我們認(rèn)為，在患者有意愿獲取最為全面的基因變異信息的情況下，晚期NSCLC患者首次基因檢測應(yīng)使用經(jīng)過NMPA或FDA批準(zhǔn)的針對腫瘤基因的CGP NGS檢測方法，這一點(diǎn)對于腫瘤樣本量少的患者尤其重要。但同時(shí)也應(yīng)當(dāng)了解NGS的應(yīng)用局限性，如受樣本取材或探針設(shè)計(jì)等因素影響或限制，NGS在某些變異類型如拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測方面存在一定的局限性。對于NGS方法可能無法準(zhǔn)確檢出的部分基因變異，應(yīng)考慮采用可靠的單基因檢測方法對NGS檢出的變異進(jìn)行驗(yàn)證[113]。

共識7：在條件允許的情況下，如患者有意愿獲取最為全面的基因變異信息，晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次基因檢測可以自行選擇NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS檢測產(chǎn)品，在全面了解腫瘤基因組信息的基礎(chǔ)上制訂一線治療方案?！綢I級推薦】

3.7 NGS液體活檢可以作為組織檢測的重要補(bǔ)充 腫瘤組織樣本的基因檢測在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍存在諸多限制，包括取樣操作的有創(chuàng)性、組織樣本有限或耗竭、腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性而導(dǎo)致采樣偏差[114,115]、無法針對所有轉(zhuǎn)移灶取樣[116]、可能因腫瘤位置特殊而無法取樣[115]、無法動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤變化[117]等。

近年來，液體活檢技術(shù)的發(fā)展為腫瘤患者提供了一種非侵入性取材的檢測路徑。液體活檢是指標(biāo)志物的收集和分析來自于各種體液，如血液、尿、痰、腦脊液和胸腔積液等。這些標(biāo)志物可以是循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、cfDNAs、cfRNAs、循環(huán)外泌體、蛋白質(zhì)及其他代謝物等[118]。

目前從血清上清液或者血漿中提取ctDNA的液體活檢技術(shù)相對成熟[119]，且大量的臨床研究證實(shí)了血液樣本中的ctDNA檢測可評估腫瘤的復(fù)發(fā)、耐藥和轉(zhuǎn)移[120]。有研究[121,122]證實(shí)，治療后ctDNA是否清零可以評估療效，ctDNA的上升也可以提前預(yù)示病情進(jìn)展。此外，為克服組織樣本檢測的局限性，bTMB檢測的應(yīng)用逐漸廣泛，從POPLAR和OAK研究[95]，再到B-FIRST[96]、BFAST研究，都顯示出bTMB預(yù)測免疫治療療效的潛力。相比組織樣本檢測，血液樣本檢測可簡化采樣流程；可多次采樣，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控；減少采樣偏差；降低取樣創(chuàng)傷和患者死亡率[123]。

除了血液ctDNA檢測外，使用腦脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和胸腔積液（malignant pleural effusion, MPE）進(jìn)行液體活檢的研究也越來越多。有研究[124]表明，對于腦轉(zhuǎn)移患者，血漿ctDNA的檢出率僅有50%左右，CSF中非腫瘤來源的DNA含量低，更容易檢測到突變。尤其是在腦膜轉(zhuǎn)移的患者中，CSF ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更優(yōu)的檢測性能[125,126]。但由于CSF的獲取方式為微創(chuàng)手術(shù)，如何篩選應(yīng)進(jìn)行CSF檢測的人群也是臨床必須考慮的問題。基于最大轉(zhuǎn)移灶直徑和全部轉(zhuǎn)移灶距離中樞神經(jīng)距離的評分系統(tǒng)，可以將非腦膜轉(zhuǎn)移的腦轉(zhuǎn)移患者的腦脊液CSF ctDNA陽性檢出率從59.09%提高至81.81%[127]。此外，也有報(bào)道[125-129]指出腦脊液中可發(fā)現(xiàn)更多獲得性耐藥基因突變。胸腔積液也是可用于NGS液體活檢的可靠標(biāo)本[130,131]。有研究者[132]認(rèn)為，在對于胸膜和腹膜受累患者進(jìn)行基因突變檢測時(shí)，更靠近轉(zhuǎn)移部位的液體（胸腔積液和胸腹水）要優(yōu)于血液，并且可以在常規(guī)臨床實(shí)踐中對這些“非血液”液體進(jìn)行基因檢測，以選擇具有特定轉(zhuǎn)移部位的癌癥患者的抗腫瘤治療藥物。值得注意的是，由于目前其他液體標(biāo)本仍缺乏大樣本量的基因變異類型與臨床靶向治療療效相關(guān)性的前瞻性研究，臨床中廣泛應(yīng)用的ctDNA檢測仍然集中于血液標(biāo)本。

盡管液體活檢有利于克服腫瘤異質(zhì)性并實(shí)現(xiàn)基因變異圖譜實(shí)時(shí)監(jiān)測，但由于體液中ctDNA含量極低，同時(shí)具有高度片段化、半衰期較短的特點(diǎn)，并且ctDNA的釋放受腫瘤類型、分期、轉(zhuǎn)移灶的部位等多種因素影響[133,134]，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。ctDNA的特點(diǎn)也對樣本處理提出了更為嚴(yán)格的要求，并對靈敏度和特異性的要求更高，否則可能會引起假陰性的結(jié)果。

雖然目前國內(nèi)尚無臨床獲得NMPA或FDA批準(zhǔn)的用于ctDNA檢測NGS產(chǎn)品，也無成熟的液體ctDNA檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但2019年3月，第一款腫瘤NGS液體活檢產(chǎn)品Personal Genome Diagnostics（PGDx）公司的ElioTMPlasma Resolve經(jīng)歐盟批準(zhǔn)上市，彌補(bǔ)了腫瘤基因檢測市場上僅有NGS組織活檢產(chǎn)品的不足，同時(shí)也宣告NGS液體活檢正式進(jìn)入臨床應(yīng)用。2020年8月7日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)液體活檢伴隨診斷試劑盒，來自Guardant Health公司的包含55個(gè)基因的Guardant 360 CDx用于識別攜帶EGFR基因突變的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，以幫助確定可以從奧希替尼治療中獲益的患者。隨后，在8月26日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了首個(gè)基于液體活檢的CGP伴隨診斷產(chǎn)品Foundation Medicine公司的FoundationOne?liquid CDx（F1LCDx）。F1LCDx經(jīng)過嚴(yán)格的技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證，可以全面準(zhǔn)確識別324個(gè)基因的四種變異類型（點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異和基因重排），且是首個(gè)同時(shí)提供免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物bMSI/bTMB以及評估ctDNA含量的伴隨診斷產(chǎn)品。

由于國內(nèi)目前暫未獲批基于液體活檢的NGS產(chǎn)品，CSCO NSCLC診療指南（2020）仍建議針對NSCLC患者的基因檢測，首選組織檢測，只有在組織標(biāo)本量不足或者組織不可及的情況下，可以選擇液體活檢作為補(bǔ)充手段。

共識8：晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次基因檢測組織樣本不足或組織檢測失敗時(shí)，經(jīng)NMPA或FDA批準(zhǔn)的液體活檢檢測產(chǎn)品可作為輔助或補(bǔ)充?！綢I級推薦】

對于腦轉(zhuǎn)移患者（包含腦膜轉(zhuǎn)移），有證據(jù)表明腦脊液ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更好的檢測性能，在條件允許的情況下，優(yōu)先使用腦脊液進(jìn)行液體活檢?！綢II級推薦】

有證據(jù)表明，胸腔積液ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更好的檢測性能，在條件允許的情況下，在胸腔積液沉渣中病理分析檢出腫瘤細(xì)胞的前提下，優(yōu)先使用胸腔積液進(jìn)行液體活檢?！綢II級推薦】

4 靶向治療耐藥NSCLC患者進(jìn)行基因檢測的共識意見

在肺癌的分子靶向藥物治療中，耐藥是臨床難以避免的挑戰(zhàn)，了解耐藥機(jī)制是合理選擇后續(xù)治療方案的前提。NSCLC靶向治療的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括驅(qū)動(dòng)基因的二次突變、旁路或下游通路激活、組織或表型轉(zhuǎn)化等。因此，對靶向治療耐藥的患者再次進(jìn)行廣泛的分子標(biāo)志物檢測有助于全面分析耐藥機(jī)制，并指導(dǎo)后續(xù)用藥。

4.1 NSCLC常見驅(qū)動(dòng)基因靶向治療耐藥后檢測 EGFRTKI耐藥機(jī)制多樣，不同藥物也存在差異。目前最常報(bào)道的一代/二代EGFR-TKI耐藥相關(guān)突變?yōu)镋GFRT790M突變。對一代/二代EGFR-TKI耐藥患者，CSCO NSCLC診療指南（2020）建議再次活檢時(shí)應(yīng)檢測EGFRT790M，T790M突變陽性患者可使用三代EGFR-TKI奧希替尼治療[6]。MET或ERBB2擴(kuò)增也與EGFR-TKI耐藥相關(guān)，NCCN指南將其納入EGFR-TKI耐藥基因檢測內(nèi)容[5]?；趶V泛的分子標(biāo)志物檢測，更多EGFR-TKI耐藥相關(guān)的基因變異不斷被發(fā)現(xiàn)，如基于FoundationOne?CDx檢測發(fā)現(xiàn)的RET重排共突變（與一代和二代EGFR-TKI耐藥相關(guān)）[135]和FGFR3-TACC3融合突變[136]，基于MSK-IMPACTTM檢測發(fā)現(xiàn)的BRAF融合、FGFR3融合、YES1擴(kuò)增、KEAP1丟失和MTORE2419K突變[137]。

一代和二代ALK-TKI藥物的耐藥基因變異存在差異。一代ALK-TKI克唑替尼治療后發(fā)生ALK耐藥突變的發(fā)生概率為20%，最常見的耐藥突變?yōu)長1196M（7%）和G1269A（4%）。二代ALK-TKI最常見的耐藥突變是G1202R：塞瑞替尼耐藥患者中最常見的耐藥突變?yōu)镚1202R（21%）、F1174C/L（16.7%）和C1156Y（8%）；阿來替尼耐藥患者中最常見的耐藥突變?yōu)镚1202R（29%），其他突變包括I1171T/S（12%）、V1180L（6%）、L1196M（6%）；Brigatinib耐藥患者中最常見的突變?yōu)镚1202R[32]。ALK-TKI耐藥患者檢出ALK耐藥突變，說明腫瘤仍為ALK依賴，使用其他ALK抑制劑可能有效。根據(jù)ALK-TKI對各種耐藥細(xì)胞株作用研究表明，三代ALK-TKI勞拉替尼對絕大多數(shù)已知ALK耐藥型突變有效[32]，但勞拉替尼對一代和二代ALK-TKI耐藥NSCLC的療效不同?？诉蛱婺嶂委熀竽退幥椅词褂眠^其他ALK抑制劑的患者，是否出現(xiàn)ALK耐藥突變并不影響勞拉替尼的療效，這可能與克唑替尼是一個(gè)不完全ALK通路抑制劑相關(guān)；而對于二代ALKTKI治療后耐藥患者，未檢出ALK耐藥突變，使用三代ALK抑制劑就很難獲益[138]。

ROS1重排陽性NSCLC患者接受克唑替尼治療后耐藥的機(jī)制目前尚不完全明確，已有的研究[139]證據(jù)提示一系列點(diǎn)突變（最常檢出的是G2032R，其他還有D2033N、L2026M、S1986Y/F、L2155S）、旁路激活（如KIT和EGFR通路激活）和下游通路異常（如RAS/RAF/MEK通路、PI3K通路、JAK/STAT通路）與克唑替尼耐藥相關(guān)。旁路激活、下游通路異常導(dǎo)致的耐藥可選擇對應(yīng)的靶向聯(lián)合治療[140]或化療/靶向聯(lián)合免疫方案[141]，第三代ALK-TKI勞拉替尼也顯示對旁路激活相關(guān)的克唑替尼耐藥腫瘤有效[142]。針對點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥，可根據(jù)具體的點(diǎn)突變選擇相應(yīng)的靶向藥物，如對攜帶G2032R的NSCLC有潛在治療作用的靶向藥物有卡博替尼和Ropotrectinib[118]。

4.2 NSCLC少見驅(qū)動(dòng)基因靶向治療耐藥后檢測 除上述NSCLC中常見驅(qū)動(dòng)基因TKI耐藥機(jī)制外，近幾年針對少見靶點(diǎn)TKI潛在耐藥機(jī)制的研究也有一些報(bào)道，具體如下。

關(guān)于靶向BRAFV600E突變治療的耐藥機(jī)制的研究比較有限。3例BRAFV600E的NSCLC患者分別在接受達(dá)拉非尼單藥或達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療耐藥后，報(bào)道了獲得性的KRASG12D、KRASG12V和NRASQ61K突變，提示可能是耐藥機(jī)制[143-145]?；贛ATCH-R（matching resistance）研究患者數(shù)據(jù)的文章[146]報(bào)道了11例針對BRAFV600E靶向治療后的潛在耐藥機(jī)制：4例患者分別檢測到了MEK1K57N、PTENN329fs、NRASQ61R以及KRASQ61R突變。綜上所述，靶向BRAFV600E治療的潛在耐藥機(jī)制主要涉及上下游RAS/MEK基因的突變以及旁路影響（PI3K通路）。

關(guān)于靶向NTRK基因融合治療的耐藥研究集中在臨床前證據(jù)以及其他癌種個(gè)例報(bào)道，肺癌作為低頻癌種尚未有相關(guān)報(bào)道。相關(guān)耐藥機(jī)制多為NTRK激酶區(qū)的獲得性耐藥突變，包括TRKAG595R/F589L/A608D/G667C、TRKCG623R/G696A，目前并未見報(bào)道發(fā)生在TRKB上的耐藥突變[41]。針對這些耐藥突變的二代NTRK-TKI，如LOXO-195[147]和TPX-0005[148]正在臨床試驗(yàn)探索階段。除NTRK耐藥突變外，NTRK-TKI也可能存在旁路激活耐藥機(jī)制，臨床前研究[149]表明IGF1R旁路激活是潛在耐藥機(jī)制；STARTRK-2研究的后續(xù)分析也報(bào)道了恩曲替尼耐藥患者中獲得性的BRAFV600E和KRASG12D突變，提示與MAPK通路的潛在相關(guān)性[150]。

MET靶向治療耐藥機(jī)制的研究主要針對MET14號外顯子跳躍突變。多篇案例[151,152]報(bào)道了克唑替尼治療MET14號外顯子跳躍突變NSCLC患者進(jìn)展后的突變位點(diǎn)，包括METD1228X和Y1230X。2019 ASCO會議上報(bào)道了更加全面的MET靶向治療潛在耐藥機(jī)制[153]，包括在靶突變（HGF擴(kuò)增、METD1228X/Y1230X/G1163R/L1195V/H1049Y以及MET14號外顯子擴(kuò)增）和旁路激活（EGFR擴(kuò)增、ERBB2擴(kuò)增[154]、KRAS擴(kuò)增、KRASG12S/G13V以及RASA1S724*），其中激酶區(qū)突變?yōu)镸ET抑制劑耐藥的主要原因。上述這些研究大部分是基于克唑替尼治療耐藥患者的研究，這些耐藥位點(diǎn)是否對新一代選擇性MET抑制劑敏感，還有待臨床探索。

針對NSCLC中ERBB2以及RET靶向治療耐藥機(jī)制的研究較少。一項(xiàng)體外研究[155]報(bào)道了C805S突變是攜帶ERBB220號外顯子突變患者接受靶向治療后的獲得性耐藥機(jī)制。另一項(xiàng)針對多例ERBB2突變NSCLC患者的回顧性分析[156]提示PIK3CA突變（R88Q）以及ERBB2擴(kuò)增是潛在耐藥機(jī)制。近期，一項(xiàng)體外研究[157]發(fā)現(xiàn)一些RET突變（L730/E732/V738/V804/Y806/A807/G810）與髓樣甲狀腺癌患者Cabozantinib、Lenvatinib、Vandetanib耐藥相關(guān)，到目前為止，這些突變還沒有在RET融合或RET突變癌癥患者的腫瘤樣本中得到證實(shí)。近期一個(gè)病例[158]報(bào)道了RET融合的NSCLC患者在Vandetanib耐藥時(shí)出現(xiàn)二次RET突變（S904F）。另一個(gè)RET融合NSCLC的案例[159]描述了V804M突變對Vandetani耐藥的影響。這些結(jié)果表明，RET激酶區(qū)突變可能是產(chǎn)生TKI耐藥的原因。

4.3 免疫治療耐藥后檢測 由于免疫治療的耐藥機(jī)制尚不清晰，并且尚無免疫治療后產(chǎn)生可靶向治療耐藥位點(diǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道，因此本共識并未對免疫治療耐藥后患者進(jìn)行相關(guān)NGS檢測的推薦。

共識9：對于靶向治療耐藥后的患者，為了更好地指導(dǎo)后續(xù)治療方案的選擇，建議使用NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS檢測產(chǎn)品再次進(jìn)行檢測?！綢I級推薦】

對于不能獲取腫瘤標(biāo)本的耐藥患者，CSCO NSCLC診療指南（2020）建議進(jìn)行基于血液樣本的cf/ctDNA檢測[6]。液體檢測因無創(chuàng)和操作便捷，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測治療效果，及早發(fā)現(xiàn)耐藥。疾病進(jìn)展時(shí)，cfDNA分析可有效識別導(dǎo)致耐藥的新發(fā)基因變異。如通過ctDNA檢測出了EGFR-TKI的新型獲得性耐藥突變FGFR3-TACC3融合，提示基因激酶區(qū)的融合可能是EGFR-TKI的耐藥機(jī)制[136]。FLAURA研究中，通過ctDNA檢測到最常見的奧希替尼耐藥相關(guān)突變?yōu)镸ET擴(kuò)增和EGFRC797S突變，其他突變包括HER2擴(kuò)增、PIK3CA和RAS突變[160]。此外，通過ctDNA檢測還發(fā)現(xiàn)了ALK抑制劑的新型耐藥突變[161-163]。

共識10：靶向治療耐藥后優(yōu)先選擇再次活檢，如無法再次進(jìn)行組織活檢或活檢組織樣本不足時(shí)，可使用經(jīng)NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS液體活檢檢測產(chǎn)品進(jìn)行補(bǔ)充檢測?！綢I級推薦】

5 NGS檢測中標(biāo)本類型和檢測流程的規(guī)范

樣本質(zhì)控對高質(zhì)量基因檢測結(jié)果至關(guān)重要。適合臨床NGS分析的樣本類型優(yōu)選新鮮組織標(biāo)本，也可選用甲醛固定-石蠟包埋樣本（formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE）、腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本及血漿（游離DNA/RNA）等[11]。

NGS檢測樣本的采集方法包括手術(shù)切除樣本、活檢小樣本、細(xì)針抽吸組織（細(xì)胞塊）和積液脫落細(xì)胞學(xué)（細(xì)胞塊）。對于未接受過靶向/免疫藥物治療的患者，NGS檢測應(yīng)首選經(jīng)病理評估的組織樣本，優(yōu)先使用手術(shù)切除樣本，也可選擇活檢樣本（選擇腫瘤含量最高或腫瘤最集中部位），再次檢測可選取液體活檢樣本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測[11,13]。接受過靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本，以尋找治療后新出現(xiàn)的耐藥突變。

各個(gè)NGS檢測實(shí)驗(yàn)室對不同樣本（新鮮組織標(biāo)本、FFPE樣本、細(xì)胞學(xué)樣本和體液/血液）的采集和處理需制訂嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operating procedure,SOP）。樣本采集最好采用一次性材料。制備不同患者病理切片樣本時(shí)，需更換新刀片，并清除操作器皿或切片機(jī)上先前樣本的殘留。

手術(shù)和活檢的新鮮組織：獲取的樣本應(yīng)含有豐富的腫瘤細(xì)胞，浸潤性腫瘤組織含有一定的淋巴細(xì)胞。手術(shù)取樣后用生理鹽水沖洗至組織表面沒有明顯血跡，避免血液中的gDNA污染。手術(shù)采集的腫塊組織不低于50 mg（豌豆粒大?。?。穿刺樣本應(yīng)≥2條，長度≥0.5 cm。新鮮組織樣本的理想保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80oC冰箱保存，這一過程應(yīng)在組織離體后30 min內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解。也可保存在樣本保護(hù)劑中，并盡早轉(zhuǎn)移至-80oC冰箱保存?？刹捎美鋬銮衅旧u估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量。

FFPE：按病理規(guī)范要求取材，盡量避免腫瘤細(xì)胞過少或未檢測到的腫瘤組織、病變中心廣泛纖維化的腫瘤、黏液產(chǎn)生過高的腫瘤、周圍炎癥嚴(yán)重的腫瘤、含壞死組織過多的腫瘤、含鈣化灶并脫鈣處理過的腫瘤。務(wù)必在組織離體后30 min內(nèi)浸入足量的4%甲醛溶液中固定（液體與組織大小比例為10:1），避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本切開后充分固定12 h-48 h，不超過72 h；小活檢標(biāo)本可固定6 h-12 h。開展NGS檢測前應(yīng)進(jìn)行HE染色，評估腫瘤細(xì)胞的含量。一般情況下，適合于NGS檢測的組織樣本中腫瘤含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上，最佳含量為30%以上。腫瘤細(xì)胞體積至少達(dá)到0.2 mm3。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)50 ng以上。若組織樣本中腫瘤細(xì)胞含量較低，仍需進(jìn)行NGS檢測的話，應(yīng)盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，并在報(bào)告中提示樣本局限性。

細(xì)胞學(xué)樣本：符合病理質(zhì)控或通過腫瘤細(xì)胞富集處理后符合要求的標(biāo)本，可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行分析。腫瘤科醫(yī)師在申請胸水標(biāo)本的基因檢測時(shí)，必須同時(shí)進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測來進(jìn)行病理評估。體腔積液標(biāo)本也可提取無細(xì)胞上清標(biāo)本中的ctDNA進(jìn)行檢測。

血漿或血液樣本：采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測，取樣時(shí)應(yīng)使用一次性的含乙二胺四乙酸（ethylen ediaminetetraacetic acid, EDTA）的抗凝真空采血管，根據(jù)檢測平臺的要求采集10 mL全血，2 h內(nèi)分離血漿，提取游離DNA后，保存于-80oC冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本專用保存管，在常溫條件下可穩(wěn)定保存3 d-7 d。

樣本運(yùn)送過程要確保各類樣本運(yùn)送安全、無污染、無降解。石蠟樣本及血檢樣本可常溫運(yùn)輸，核酸樣本需在4oC或冷凍條件下運(yùn)輸。

共識11：NSCLC的NGS檢測樣本的采集處理和保存應(yīng)符合規(guī)范要求。未接受過靶向/免疫藥物治療的患者，NGS檢測應(yīng)首選經(jīng)病理評估的組織樣本。接受過靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本?！綢級推薦】

NGS檢測的全部流程主要包括實(shí)驗(yàn)室操作和生物信息學(xué)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)室操作部分包括從符合送檢要求的樣本中提取DNA、基于雜交捕獲或擴(kuò)增子建庫方法進(jìn)行文庫制備、目標(biāo)區(qū)域富集、測序等；生物信息分析部分是對于不同類型變異（包括堿基替換、插入/缺失、拷貝數(shù)改變和基因重排）采用特定生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行分析并結(jié)合藥物注釋信息給出臨床報(bào)告。送檢樣本及全部測序和分析報(bào)告流程應(yīng)符合《臨床分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室二代基因檢測專家共識》、《二代測序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診療中的應(yīng)用專家共識》等共識基本要求[11,13]，充分關(guān)注試劑管理、樣本的質(zhì)控/質(zhì)量保證、檢測環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度，NGS技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（包括文庫構(gòu)建、測序流程、質(zhì)控等）等環(huán)節(jié)，配備獨(dú)立的質(zhì)量控制程序。

共識12：NSCLC的NGS檢測流程應(yīng)符合規(guī)范要求，配備完善的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和獨(dú)立的質(zhì)量控制程序?！綢級推薦】

6 NGS檢測報(bào)告的臨床解讀

NGS檢測結(jié)果轉(zhuǎn)化為患者的個(gè)體化精準(zhǔn)診療方案，需要基于多個(gè)分子標(biāo)志物的臨床或臨床前分子生物學(xué)證據(jù)，并結(jié)合患者診療史準(zhǔn)確判斷證據(jù)優(yōu)先級，個(gè)性化地解讀基因檢測報(bào)告?；谂R床信息的傳統(tǒng)腫瘤多學(xué)科協(xié)作治療模式（multidisciplinary team, MDT）可能無法滿足肺癌臨床日益增長的基因檢測報(bào)告解讀需求，尤其是對于耐藥后有多種潛在治療方案的患者，需要結(jié)合患者診療史對不斷更新的證據(jù)等級進(jìn)行個(gè)性化排序。由此看來，組建由腫瘤科醫(yī)師、病理科醫(yī)師、分子生物學(xué)專家、生物信息學(xué)專家等多個(gè)專業(yè)領(lǐng)域?qū)＜医M成的肺癌分子腫瘤專家委員會（molecular tumor boards, MTB），討論分子生物學(xué)相關(guān)證據(jù)，優(yōu)化患者的個(gè)體化診療方案，并建立基于分子標(biāo)志物檢測的臨床治療路徑或許是更優(yōu)的解決方案。進(jìn)入NSCLC-MTB的腫瘤科醫(yī)師需要基于患者的臨床病理學(xué)信息發(fā)起基因檢測需求，熟悉基因變異信息對應(yīng)的患病風(fēng)險(xiǎn)、靶向治療、預(yù)后療效等臨床應(yīng)用價(jià)值，并對患者基于分子檢測的治療方案進(jìn)行跟蹤隨訪，以確認(rèn)分子標(biāo)志物陽性患者的真實(shí)世界療效；病理科醫(yī)師能夠評估患者的腫瘤標(biāo)本特征并提供符合檢測需求的送檢樣本，如在院內(nèi)病理科進(jìn)行NGS檢測，還需要病理科醫(yī)師對于檢測流程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可信；分子生物學(xué)及生物信息學(xué)專家主要負(fù)責(zé)分析基因變異和進(jìn)行藥物相關(guān)性注釋，及時(shí)更新數(shù)據(jù)庫的證據(jù)等級以便進(jìn)行更準(zhǔn)確的基因變異與藥物相關(guān)性注釋，并協(xié)助臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)收集。如有需要，NSCLC-MTB還應(yīng)包括腫瘤放射科、腫瘤外科、遺傳學(xué)和藥理學(xué)等其他?？祁I(lǐng)域的專家。

共識13：二代測序技術(shù)為NSCLC患者帶來了更多更全面的基因突變信息，倡導(dǎo)各單位組建NSCLC-MTB，以正確解讀基因檢測的結(jié)果，制定個(gè)體化臨床治療決策?！綢I級推薦】

表 4 二代測序技術(shù)在NSCLC中的臨床應(yīng)用中國專家共識要點(diǎn)Tab 4 Summary of recommendations

7 展望

二代測序技術(shù)的全面應(yīng)用，將為NSCLC患者個(gè)體化臨床診治奠定基礎(chǔ)（表4-表6）。未來可以通過對患者臨床診療信息、基因檢測結(jié)果、后續(xù)治療方案的全程管理，建立NSCLC患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療平臺，同時(shí)積累真實(shí)世界數(shù)據(jù)，不斷豐富和完善我國NSCLC患者的個(gè)體化診療全景圖。此外，重視腫瘤臨床醫(yī)師與病理科醫(yī)生、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)專家的合作，構(gòu)建分子腫瘤專家委員會的新型多學(xué)科診療模式也是腫瘤臨床和研究的重要發(fā)展方向。

表 5 共識證據(jù)類別Tab 5 Evidence level

表 6 共識推薦等級Tab 6 Recommendation level

本共識專家組成員