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    Cyr61作為對乙酰氨基酚致急性肝損傷的潛在預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物研究

    2020-10-22 08:02:20朱景麗黃亞彬何麗娟
    肝臟 2020年9期
    關(guān)鍵詞:引物肝臟急性

    朱景麗 黃亞彬 何麗娟

    對乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol, paracetamol, APAP)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的非處方解熱鎮(zhèn)痛藥,過量使用APAP可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷[1]。當(dāng)肝臟發(fā)生壞死損傷時(shí),血清酶ALT和AST的升高可作為肝損傷的指標(biāo),然而它們對預(yù)測肝損傷或急性肝功能衰竭的嚴(yán)重程度并不敏感[2]。因此有必要尋找新型、特異性及靈敏度高的生物學(xué)標(biāo)志物以指導(dǎo)臨床診療工作。

    Cyr61是結(jié)締組織生長因子家族(CCN)的一員,在細(xì)胞增殖、黏附、遷移、血管生成和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Cyr61有希望成為急性心肌損傷及腎損傷的早期標(biāo)志物[4-5]。在肝臟疾病研究中,Cyr61與促進(jìn)肝纖維化的消退、肝星狀細(xì)胞凋亡以及肝癌的發(fā)生有關(guān)[6]。目前尚無關(guān)于APAP誘導(dǎo)的肝損傷患者血漿或肝臟Cyr61水平變化的報(bào)道。因此,本研究通過制備APAP化學(xué)性急性肝損傷大鼠模型,檢測大鼠血漿和肝臟中Cyr61濃度是否發(fā)生變化。

    資料與方法

    一、動(dòng)物與試劑

    健康SPF級雄性Wistar大鼠92只,體質(zhì)量200~250 g,購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22~25 ℃,循環(huán)光照(12 h亮/12 h暗),適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。APAP處理前禁食12 h。APAP(美國Sigma公司),TRIzol裂解液(美國Invitrogen公司),PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本TAKARA公司),SYBR Premix Ex Taq(日本TAKARA公司),qRT-PCR引物(上海生物化工有限公司);鼠Cyr61 Elisa試劑盒(英國Abcam公司)。

    二、實(shí)驗(yàn)方法

    (一)急性肝損傷模型的制備 大鼠隨機(jī)分為2組(每組n=10):對照組、APAP處理組。APAP處理組通過胃管給予250 g/kg體質(zhì)量的APAP(重懸于0.9%生理鹽水,加熱溶解,終濃度為25 mg/mL),對照組胃管給予0.9%生理鹽水[7]。處理24 h后處死大鼠,收集2組大鼠血清和肝組織,常規(guī)檢測血清ALT和AST表達(dá)水平,肝組織檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和谷胱甘肽(GSH)水平,結(jié)果示:與對照組相比,APAP處理組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05);APAP處理組肝組織中的SOD、GSH水平明顯增加(P<0.05),MDA和NO水平顯著降低(P<0.05),提示APAP誘導(dǎo)大鼠藥物性肝損傷模型成功建立。

    (二)動(dòng)物處理 大鼠隨機(jī)分為3組(每組n=24):對照組、APAP處理組、APAP+還原型谷胱甘肽(阿拓莫蘭, GSH)治療組(模型建立24 h后尾靜脈注射GSH 400 mg/kg)[8]。每組在模型建立后在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別取4只大鼠留取血清,常規(guī)檢測ALT、AST。收集血清后處死大鼠,留取肝組織部分進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。

    (三)qRT-PCR測肝組織Cyr61 mRNA相對水平 TRIzol法提取血漿和肝組織的mRNA,260 nm波長測得RNA濃度,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,使用SYBR Green擴(kuò)增目的基因,GAPDH作為管家基因,2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)水平的變化倍數(shù),引物序列如下:Cyr61前引物(5′-3′)CGCGAAGC-AACTCAACGAGG,后引物(5′-3′)GAGACAGTTCTT-GGGGACACA;GAPDH前引物(5′-3′)TGCTGGTGCTGA-GTATGTCG,后引物(5′-3′)AGTTGGTGGTGCAGGATGC。

    (四)酶聯(lián)免疫吸附測定法(Elisa)檢測血清Cyr61表達(dá):根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Cyr61濃度。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、大鼠血清ALT、AST表達(dá)水平變化

    在APAP處理后2 h,血清ALT水平開始升高(P<0.05),2 h~12 h期間隨處理時(shí)間延長,血清ALT水平越來越高(P<0.05),24 h時(shí)趨于平穩(wěn)(12 h與24 h表達(dá)無差異,P>0.05);血清AST變化水平規(guī)律與ALT一致。

    二、大鼠血清Cyr61表達(dá)水平變化

    在獲得Elisa數(shù)據(jù)后,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)回歸方程y=227.12x+8.96(y值為濃度,x值為OD值,R2=0.998)計(jì)算Cyr61濃度水平。如表1所示,與對照組相比,APAP處理組大鼠血清Cyr61水平在1~8 h逐漸升高(P<0.05),8 h和12 h的表達(dá)水平無差異(P>0.05),24 h時(shí)Cyr61表達(dá)水平降低(P<0.05);APAP+GSH治療組血清的Cyr61水平明顯低于APAP處理組(P<0.05),且與APAP處理組一致,Cyr61水平升高于8 h和12 h趨于穩(wěn)定(P<0.05,8 h與12 h相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05),24 h降低(P<0.05)。

    表1 三組大鼠血清Cyr61表達(dá)水平變化(±s, pg/mL)

    三、大鼠肝臟Cyr61 mRNA表達(dá)水平變化

    如圖1所示,APAP處理組大鼠造模1~8 h的肝臟Cyr61 mRNA水平呈上升趨勢,8 h時(shí)到達(dá)峰值,12和24 h時(shí)表達(dá)水平下降,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與APAP處理組相比,APAP+GSH治療組大鼠的Cyr61轉(zhuǎn)錄水平與APAP處理組相比明顯降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    a表示在APAP處理組間,與1 h比較,P<0.05;b表示APAP處理組與APAP+GSH治療組比較,P<0.05。圖1 三組大鼠肝臟Cyr61 mRNA表達(dá)相對水平

    討 論

    在過去的幾十年里,APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷在世界各國中較為常見[9]。臨床上通過測定ALT和AST水平以監(jiān)測和評估APAP誘導(dǎo)的肝損傷情況,但這些指標(biāo)缺乏特異性。為更好地進(jìn)行評估患者預(yù)后,尋找更特異的急性肝損傷生物學(xué)標(biāo)志物是目前的研究重點(diǎn)。

    近年來人們對Cyr61的研究逐漸增多,目前已知其為細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)的血管調(diào)節(jié)因子。有研究通過建立大鼠腎臟急性缺血再灌注(I/R)模型檢測Cyr61表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)Cyr61在腎損傷中的變化規(guī)律[10]。目前尚無關(guān)于Cyr61與急性肝損傷的研究數(shù)據(jù),我們通過建立APAP誘導(dǎo)急性肝損傷模型,檢測Cyr61 mRNA發(fā)現(xiàn)其變化同樣具有規(guī)律性,在造模后1 h肝組織表達(dá)Cyr61水平升高,2~8 h逐漸升高至峰值,12~24 h時(shí)逐漸降低;APAP+GSH治療組Cyr61的表達(dá)明顯低于APAP處理組,變化規(guī)律與其一致。而在血清中,我們檢測到在造模后1 h,Cyr61表達(dá)水平升高,2~8 h逐漸升高至峰值,12 h趨于平穩(wěn),24 h時(shí)Cyr61水平降低;APAP+GSH組Cyr61水平顯著低于APAP處理組,且Cyr61變化規(guī)律與APAP處理組一致。以上結(jié)果提示我們,Cyr61在APAP所致急性肝損傷及治療后損傷減輕情況的評估有一定指導(dǎo)意義。另外,Cyr61在大鼠肝臟發(fā)生急性損傷后的表達(dá)水平變化均早于ALT及AST,提示Cyr61可能是針對APAP所致急性肝損傷更為敏感和特意的生物學(xué)指標(biāo),值得在臨床研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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