三七皂苷R1-PLGA 納米微球的制備及優(yōu)化研究*

楊 丹，姜 嵐，黃 娟，陳曉莉，楊嬌娜

（1.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲科/云南省超聲診斷質(zhì)量控制中心/云南省超聲影像研究中心，云南 昆明 650032）

前 言

三七皂苷R1 來源于中藥三七（Panaxnotoginseng）的干燥根及根莖，研究顯示其內(nèi)的有效成分三七皂苷R1 對急性心梗的大鼠心肌具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減少心肌酶釋放以及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。但是生物體對藥物的吸收、代謝、排泄是一個極其復(fù)雜的過程，中藥產(chǎn)生的藥理效應(yīng)不能唯一的歸功于該藥物的化學(xué)組成成分，還應(yīng)與藥物的物理狀態(tài)等密切相關(guān)。納米中藥是指運(yùn)用納米技術(shù)制造的中藥有效成分、原藥及其復(fù)方制劑[2]。PLGA 是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域[3]，目前國內(nèi)外有很多學(xué)者們使用PLGA 作為殼載體來包埋藥物制作納米微球[4～6]。PLGA 作為納米粒微球成膜材料，將其內(nèi)的藥物與外界隔開，減少外界環(huán)境與藥物之間的相互影響，達(dá)到較高的包封率，是親水性藥物的理想載體[7～9]。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

三七皂苷R1（上海源葉生物科技有限公司）；聚乳酸- 羥基乙酸共聚物（PLGA，相對分子質(zhì)量，LA∶GA=50∶50，Aladdin industrial Corporation）；二氯甲烷、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol,PVA，Sigma-Aldrich Corporation）。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID）；高效液相色譜儀（Agilent1260 Infinity）；Hypersil GOLD 液相色譜柱（250×4.6mm×5μm，Thermoscientific）；Malvern 激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；磁力攪拌器（溫州標(biāo)諾儀器有限公司，78-1）、低溫冷凍離心機(jī)（AllegraR X-15R）；超純水儀（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司，UPT-I-5/10/20T）；電子天平（Precisa ES225SM-DR）。

1.2 三七皂苷R1-PLGA 微球的制備及參數(shù)優(yōu)化

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels for the orthogonal experiment

采用復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法制備以PLGA 為攜藥載體的納米粒微球。精密稱取一定質(zhì)量的PLGA 并放入一定體積的二氯甲烷中，振蕩使其充分溶解，制成PLGA- 二氯甲烷溶液（油相O）；稱取一定質(zhì)量的三七皂苷R1 并制成相應(yīng)濃度的PNS 水溶液作為內(nèi)水相 W1；PVA 水溶液（1%）作為外水相 W2。以一定體積比混合W1相與O 相，將混合乳液置入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行第一次超聲乳化（300W，T1），制得初乳（W1/O），將初乳W1/O 快速加入到一定體積的外水相W2中，再次置入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行第二次超聲乳化（300W，T2），即可得到復(fù)乳。將得到的復(fù)乳置于室溫下攪拌4h，使得有機(jī)溶劑揮發(fā)，即得三七皂苷R1-PLGA 納米微球混懸液。將上述液體分裝入離心管內(nèi)，高速離心（4000r/min）5min,收集上清液，蒸餾水洗滌三次收集全部上清液。洗滌后的混懸液沉淀干燥后收集即得納米粒干粉，置4℃冰箱中保存、備用。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)單因素分析后篩選出在制備過程中對包封率及粒徑有影響的五種因素，X1（O 相PLGA 濃度，mg/mL）、X2（W1與O 相體積比）、X3（外水相 W2與初乳 W1/O 體積比）、X4（第一次超聲乳化時間，T1）、X5（第二次超聲乳化時間，T2）；每個因素選4 個水平，按L16（45）正交表安排實(shí)驗(yàn)，水平重復(fù)每一相同實(shí)驗(yàn)三次，見表1。

1.3 三七皂苷R1 含量測定

使用儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）及HypersilGOLD液相色譜柱（250×4.6mm×5μm，Thermoscientific）。以乙腈為流動A 相，水為流動B相，按照下表2 進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量20μL；流速1.0mL/min；檢測波長203nm。

表2 高效液相梯度洗脫條件Table 2. Gradient elution conditions in high performance liquid phase

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

三七皂苷R1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別稱取一定質(zhì)量三七皂苷R1，配制不同濃度三七皂苷R1 溶液，按照前述1.3 色譜條件得到的結(jié)果，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（ρ）進(jìn)行線性回歸，得到三七皂苷R1 標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=2.9943ρ+3.2929（r=0.9803）。

1.5 包封率的測定

取1.2 項(xiàng)下離心收集的所有上清液，據(jù)1.3 色譜條件，測定游離藥物量（cfree），按以下公式計(jì)算包封率（entrapmentefficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以正交試驗(yàn)各序號對應(yīng)試驗(yàn)條件制備的三七皂苷R1-PLGA 微球的包封率（%）及平均粒徑為指標(biāo)，結(jié)果如表3。馬爾文粒徑分析儀得出的微球粒徑如圖1 所示。

圖1 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑分析圖Fig. 1 The analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

使用SPSS 13.0 對表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表 4～7。

表3 三七皂苷R1-PLGA 包封率及粒徑正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The orthogonal experiment results of the encapsulation rate and particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表4 三七皂苷R1-PLGA 微球包封率單因素分析表Table 4 The single factor analysis of encapsulation rate of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表5 三七皂苷R1-PLGA 微球包封率正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表Table 5 The variance analysis of encapsulation rate of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表6 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑單因素分析表Table 6 The single factor analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表7 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表Table 7 The variance analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

由表 4～7 可知，對于包封率和粒徑來說，X1、X2、X3、X4、X5五個因素均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對于包封率的影響，五個因素次序依次為X1>X3>X5>X2>X4。對于包封率來說，要達(dá)到最佳包封率，每個因素最佳的水平分別為：PLGA 濃度10mg/mL，W1∶O為 3∶10，W2∶W1/O 為 10∶1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）90s；對于粒徑的影響，五個因素次序依次為X1>X2>X3>X5>X4。對于粒徑來說，要達(dá)到最小粒徑，每個因素最佳的水平分別為：PLGA 濃度 20mg/mL，W1∶O 為 2∶5，W2∶W1/O 為 2∶1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）120s。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的納米粒由PLGA 包覆三七皂苷R1，由于三七皂苷R1 是水溶性藥物，因此采用了適宜水溶性藥物包封的復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法。并且在外水相中加入了一定濃度的PVA 作為乳化劑,使得有機(jī)相在乳化劑作用下于水相中分散成細(xì)小液滴，保證足夠的表面活性劑分子覆蓋有機(jī)相與外部水相界面，提高液滴的聚結(jié)保護(hù)作用[5]。通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察各因素，以包封率及粒徑為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化制備工藝。正交設(shè)計(jì)五因素四水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對于包封率和粒徑來說，PLGA 濃度，W1與O 相體積比、外水相W2與初乳W1/O 體積比、第一次超聲乳化時間、第二次超聲乳化時間對其均有影響。PLGA濃度過低，不足以完全包封體系中的三七皂苷R1，而當(dāng)PLGA 濃度過高時，體系內(nèi)的三七皂苷R1 濃度不變，PLGA 相對過剩，反而不能有效提高包封率，故當(dāng)PLGA 濃度在20mg/mL 時包封率達(dá)到最佳；內(nèi)水相體積增大，在一定范圍內(nèi)包封率上升，但當(dāng)上升至一定程度時反而包封率下降，最佳的內(nèi)水相與油相比值為3∶10，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相符[10]。而隨著外水相與初乳（W1/O）體積比的增加，包封率上升，并且在300W 超聲乳化下，第一次內(nèi)水相油相混合乳化時間為10s，第二次外水相與初乳混合乳化時間為90s 時則包封率最高。對于納米粒微球粒徑來說，隨著PLGA 濃度的增加，粒徑逐漸減小,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的相符[11]；內(nèi)水相、油相比也影響著粒徑的大小，當(dāng)比值較大時粒徑較大，減小比值則粒徑減??；而外水相與初乳的比值增大，則粒徑也增大。隨著第一次超聲乳化時間的延長，粒徑增加，這與文獻(xiàn)相符[4]，因此內(nèi)水相與油相超聲乳化時間選擇10s 為佳。

綜上所述，可以使用復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法成功制備三七皂苷R1-PLGA 納米粒微球，其包封率及粒徑大小會受PLGA 濃度，W1與O 相體積比、外水相W2與初乳W1/O 體積比、第一次超聲乳化時間、第二次超聲乳化時間影響。要獲得最大包封率，優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件為：PLGA 濃度 10mg/mL，W1∶O 為 3∶10，W2∶W1/O 為10∶1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）90s。如果要獲得最小粒徑，則優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為：PLGA 濃度 20mg/mL，W1∶O為 2∶5，W2∶W1/O 為 2∶1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）120s。