EZH2 蛋白在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及其機制研究

齊 慧，呼 群，蘇烏云，賈永峰，陳連香，曹冉華，烏日罕

肺癌是目前我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%[1]，嚴重危害人類健康。 雖然近年在肺癌化療及分子靶向治療方面取得了很大的進步，但總體治療效果仍不理想，抗腫瘤藥物耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的重要原因之一。 探討肺癌耐藥的分子機制，有助于為治療肺癌提供新的靶點和途徑，在化療藥物選擇方面為臨床提供指導(dǎo)意見。 Zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)蛋白是多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的催化活性亞單位，是多聚梳群蛋白家族的主要成員，定位于人類染色體7q35 位置，可對組蛋白H3 第27 位賴氨酸進行甲基化修飾，從而介導(dǎo)目的基因沉默和轉(zhuǎn)錄抑制作用[2]。 EZH2 蛋白在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、改變細胞周期、促進腫瘤轉(zhuǎn)移以及參與耐藥等方面發(fā)揮重要作用[3]。 目前已發(fā)現(xiàn)EZH2 蛋白在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中高表達[4-6]。 近年研究顯示EZH2 蛋白在NSCLC 中高表達，并與患者預(yù)后相關(guān)[7]，可能與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。且EZH2 蛋白的過表達促進了肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。 此外，EZH2 蛋白在腫瘤耐藥中也發(fā)揮作用，在卵巢癌細胞中抑制EZH2 蛋白表達能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[10]。 在肝癌細胞中沉默EZH2 基因后可使其對氟尿嘧啶的耐藥性降低[11]。目前EZH2 蛋白對NSCLC 順鉑耐藥的作用尚不明確，而且對其調(diào)控肺癌耐藥的機制了解甚少。 本研究采用RNA 干擾技術(shù)抑制人肺腺癌細胞順鉑耐藥株A549/DDP 中EZH2 的表達，研究EZH2 蛋白與順鉑耐藥的關(guān)系及其調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑 人肺腺癌細胞株A549 購自江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，人肺腺癌細胞順鉑耐藥株A549/DDP 購自北京銀紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司(中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所)。 主要試劑:RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國HyClone 公司，DH5α 感受態(tài)大腸桿菌菌株購自美國Invitrogen 公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Lipofectamine 2000 reagent 購自美國Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，PCR 引物由中美泰和生物有限公司合成，順鉑購自山東齊魯制藥廠，細胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按照貼壁細胞培養(yǎng)方法常規(guī)培養(yǎng)A549 及A549/DDP。 使用含1%青鏈霉素混合液及10%胎牛血清的改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基配制而成的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒擴增及提取 取2 種序列重組質(zhì)粒piGene-shEZH2 和空質(zhì)粒piGene-shNega 進行擴增，該重組質(zhì)粒由本課題組呼群教授前期合成，具體序列為:piGene-shEZH2:5′-GGACGGCTCCTCTAACCA TGTTTACAACT-3′，piGene-shNega:5′-GTGCATGATG TGTACCCTTTGGTTCATAGA-3′。取重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌菌株，于LB 培養(yǎng)基中擴增，獲得大量擴增的質(zhì)粒，使用試劑盒進行質(zhì)粒提取。

1.2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP 細胞 使用Lipofectamine2000 試劑將重組質(zhì)粒piGene-shEZH2與空質(zhì)粒piGene-shNega 轉(zhuǎn)染到A549/DDP 細胞中。將A549/DDP 細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。 按照Lipofectamine2000 試劑說明進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h 后，加400 μg/mL G418 抗生素篩選14 d，常規(guī)換液。 14 d 后見具有抗藥性的克隆形成，獲得穩(wěn)定表達的細胞A549/DDP-shEZH2、A549/DDPshNega，后續(xù)以200 μg/mL G418 維持培養(yǎng)。qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 細胞毒性實驗 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，接種密度為5000個細胞/孔，細胞培養(yǎng)24 h后加順鉑作用，順鉑濃度依次為0.1、1、10、50、100和150 μmol/L。 同時設(shè)置陰性對照組。 加順鉑培養(yǎng)24 h 后，加入細胞毒性實驗檢測試劑。 繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h 后，用酶標儀測定450 nm 處的光密度(optical delnsity，OD)值，實驗重復(fù)3 次。 分別檢測A549 與A549/DDP 及轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP 對順鉑的耐藥性差異，計算公式:抑制率＝(陰性對照組OD 值-實驗組OD 值)/(陰性對照組OD 值)×100%，計算半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory concentration，IC50)值。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 分別提取A549、轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP 細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進行qRT-PCR，選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，引物序列為:EZH2-上游引物:5′-CAGGCTGGGGGATTTTT ATC-3′，EZH2-下游引物:5′-CACTTTCCCTCTTCTGT CAGCTTC-3′；P21-上游引物:5′-ACCTGTCACTGTCTT GTACC-3′，P21-下游引物:5′-GGCGTTTGGAGTGGTA GAA-3′；Bad-上 游 引物:5′-CCAGCAGGAGCAGCCA AC-3′，Bad-下游引物:5′-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′；Puma-上游引物:5′-CGACCTCAACGCACAGTAC-3′，Puma-下游引物:5′-CAGGCACCTAATTGGGCTC-3′；GAPDH-上游引物:5′-CCTCAACGACCACTTTGT CA-3′，GAPDH-下游引物:5′-TTACTCCTTGGAGGCC ATGT-3′。 按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)使用ABI7300 qRT-PCR儀。此實驗重復(fù)3 次。采用2-△△Ct法計算數(shù)據(jù)。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測 采用碘化丙啶單染色法對 A549/DDP、 A549/DDP-shEZH2、 A549/DDPshNega 進行流式細胞檢測，測定細胞周期。 取對數(shù)生長期細胞，加入70%乙醇于4 ℃固定1 h，然后加入RNA 酶(終濃度20 μg/mL)，置于37 ℃水浴中孵育30 min，加500 μL 碘化丙啶PI 染液，置于4 ℃冰箱，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析；計數(shù)資料采用率表示，行χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A549/DDP 和A549 對順鉑的敏感性 A549/DDP 的IC50 值為(34.57±3.70)μmol/L，A549 的IC50 值為(5.89±0.97)μmol/L，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，A549 細胞對順鉑較敏感，而A549/DDP 則對順鉑敏感性差，圖1。

2.2 A549 和A549/DDP 中EZH2 mRNA 的表達情況 qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，EZH2 的mRNA 在A549/DDP 中呈高表達，其相對表達水平為A549 的(1.97±0.02)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，圖2。

圖1 順鉑作用后A549 和A549/DDP 的細胞存活率

圖2 A549/DDP 中EZH2 的mRNA 表達

2.3 A549 和A549/DDP 中P21、Puma、Bad mRNA的表達情況 qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，在A549/DDP 中P21、Puma 的mRNA 表達水平明顯低于A549，P21 為(0.20±0.02)倍，Puma 為(0.18±0.02)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；Bad 的mRNA 在A549/DDP 中也呈低表達，Bad 為(0.78±0.04)倍，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，圖3。

圖3 A549 和A549/DDP 中P21、Puma、Bad 的mRNA 的表達

2.4 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞中EZH2 的mRNA的表達情況 A549/DDP-shEZH2 細胞相對表達量為A549/DDP 的(63.54±3.42)%，抑制EZH2 表達的效果明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，選擇該組細胞繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。 A549/DDP-shNega組的相對表達量為A549/DDP 的(98.03±1.21)%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，圖4。

圖4 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞中EZH2 的mRNA 的表達

2.5 順鉑作用后A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞存活率細胞毒性實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞耐藥性的變化，A549/DDP-shEZH2 的IC50 為(18.91±2.07)μmol/L，與A549/DDP 的IC50(34.57±3.70)μmol/L 比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；A549/DDP-shNega 的IC50 為(35.43±2.39)μmol/L，與A549/DDP 比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，圖5。

2.6 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞中P21、Puma、Bad mRNA 的表達情況 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染前后細胞中P21、Puma、Bad 表達的變化，結(jié)果顯示，抑制EZH2 基因表達后，P21、Puma、Bad 的mRNA 表達均上調(diào)，P21 mRNA 相對表達量為A549/DDP 的(5.81±0.21)倍，Puma 為(3.12±0.04)倍，Bad 為(1.53±0.02)倍，差異有統(tǒng)計學意義(三者均P＜0.05)。A549/DDP-shNega組的表達量與A549/DDP 比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，圖6。

2.7 抑制EZH2 基因表達后A549/DDP 細胞周期變化情況 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的細胞周期，結(jié)果顯示，A549/DDP-shEZH2組細胞G0/G1 期所占比例為(58.85±5.67)%，S 期為(16.95±4.84)%，G2/M 期為(22.8±4.29)%；A549/DDP-shNega組細胞G0/G1 期所占比例為(78.35±1.03)%，S 期為(10.05±1.96)%，G2/M 期為(12.55±1.56)%；A549/DDP 細胞G0/G1 期所占比例為(76.83±5.11)%，S 期為(9.08±1.77)%，G2/M 期為(14.13±3.58)%。 抑制EZH2 基因表達后A549/DDP 細胞的G0/G1 期細胞比例下降，而G2/M 期細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；A549/DDPshNega 與A549/DDP 細胞周期的變化比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，圖7，圖8。

圖5 順鉑作用后A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞存活率

圖6 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞中P21、Puma、Bad mRNA 的表達

圖7 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞的細胞周期分布

圖8 A549/DDP 和轉(zhuǎn)染后細胞的細胞周期變化

3 討論

肺癌耐藥已經(jīng)成為目前臨床治療中的一大難題，而肺癌對順鉑形成耐藥的機制十分復(fù)雜，有多種耐藥相關(guān)分子參與其中，調(diào)控方式涉及到藥物轉(zhuǎn)運、藥物代謝、DNA 損傷修復(fù)、血管生成、細胞凋亡以及細胞周期調(diào)節(jié)等方面。

惡性腫瘤中存在著廣泛的表觀遺傳學改變，如DNA 甲基化和組蛋白修飾等，其與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 而DNA 甲基化和組蛋白乙?；谀[瘤化療耐藥中也起重要作用。 在DNA 形成染色質(zhì)的過程中，組蛋白作為重要的組成部分調(diào)控基因的表達。 研究表明[12]，DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑可逆轉(zhuǎn)因DNA 甲基化所致的化療敏感基因抑制，使其表達恢復(fù)上調(diào)，從而使腫瘤對順鉑的敏感性恢復(fù)。而在組蛋白去乙酰化酶抑制劑的研究中也觀察到類似的作用[13]。

研究表明，EZH2 蛋白高表達與NSCLC 預(yù)后不良有關(guān)[7]。 近年的文獻報道EZH2 蛋白可能參與腫瘤細胞的耐藥。 在卵巢癌細胞中抑制EZH2 表達能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[10]。 EZH2 蛋白在胰腺癌中高表達，其與胰腺癌惡性程度和細胞增殖密切相關(guān)，抑制EZH2 基因表達可使腫瘤細胞對阿霉素和2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷的敏感性增加，引起細胞凋亡[14]。

本研究選擇NSCLC 細胞株A549 及其耐藥株A549/DDP 為研究對象，首先檢測驗證A549 和A549/DDP 中EZH2 蛋白的表達和對順鉑的耐藥性。 結(jié)果顯示耐藥株A549/DDP 中EZH2 蛋白呈高表達，提示EZH2 與A549/DDP 的耐藥性相關(guān)。 為了進一步的研究EZH2 蛋白與NSCLC 耐藥的關(guān)系，采用RNA干擾技術(shù)抑制A549/DDP 中EZH2 蛋白的表達，選擇EZH2 特異性的shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞，獲得穩(wěn)定抑制EZH2 蛋白表達的A549/DDP細胞。 通過對該細胞的耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)，A549/DDP 對順鉑的耐藥性下降，提示抑制EZH2 蛋白可以部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP 對順鉑的耐藥性。 說明EZH2 蛋白在NSCLC 對順鉑的耐藥中發(fā)揮作用。

為了進一步探討EZH2 蛋白是通過何種機制在NSCLC 對順鉑的耐藥中發(fā)揮作用，本課題組檢測分析了EZH2 對細胞凋亡相關(guān)基因和細胞周期相關(guān)基因的影響。 首先，對細胞凋亡通路中的相關(guān)基因Puma 和Bad 進行了檢測，結(jié)果顯示，與A549 相比，A549/DDP 中Puma、Bad 的mRNA 均呈低表達，雖然Bad 無統(tǒng)計學差異，但仍有下降趨勢。 抑制A549/DDP 中EZH2 表達后，Puma、Bad 的mRNA 表達上調(diào)，提示EZH2 對凋亡基因Puma、Bad 具有抑制作用。 有研究發(fā)現(xiàn)[15]，在肺癌中抑制EZH2 基因表達，可引起細胞增殖抑制，并促進細胞凋亡。EZH2 抑制劑GSK343 與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用能夠克服肺癌細胞PC9/AB2 對吉非替尼的耐藥作用，能夠顯著抑制耐藥細胞的活性，降低細胞的遷移能力并誘導(dǎo)耐藥細胞的凋亡[16]。 由此推測，EZH2 可能通過抑制凋亡基因Puma、Bad 的表達參與對細胞凋亡通路的調(diào)控，使細胞凋亡減少，拮抗化療藥物引起的細胞凋亡，從而誘導(dǎo)NSCLC 產(chǎn)生耐藥。 然而細胞凋亡通路的調(diào)控非常復(fù)雜，各通路之間存在交叉作用，所以EZH2 對NSCLC 耐藥中凋亡的調(diào)控機制仍有待進一步研究。

本研究對細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子P21 進行了檢測，發(fā)現(xiàn)P21 的mRNA 在A549/DDP中呈低表達，通過RNA 干擾使EZH2 表達抑制后，P21 的mRNA 表達上調(diào)，提示EZH2 對P21 具有抑制作用。 采用流式細胞儀對轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP進行細胞周期檢測，結(jié)果顯示抑制A549/DDP 中EZH2 表達后，細胞周期中G0/G1 期細胞減少，而G2/M 期細胞比例增加，細胞發(fā)生了G2/M 期阻滯，提示EZH2 可能通過影響細胞周期在肺癌耐藥細胞的增殖中發(fā)揮作用。 研究報道[17]，在前列腺癌和乳腺癌中，抑制EZH2 的表達同樣可使細胞發(fā)生G2/M期阻滯。 在對pRB-E2F 生長調(diào)控通路的研究中發(fā)現(xiàn)[17]，抑制EZH2 可使增殖相關(guān)基因cyclinDl，cyclinEl 表達減少，說明EZH2 可能通過調(diào)控增殖相關(guān)基因而對細胞周期產(chǎn)生影響，從而在腫瘤細胞增殖中發(fā)揮作用。 因此，我們推測，EZH2 可能通過抑制P21 表達而使其調(diào)控細胞周期、抑制細胞增殖的作用減弱，從而促進NSCLC 細胞周期進展，使其惡性增殖能力增強，誘導(dǎo)NSCLC 產(chǎn)生耐藥。 然而，也有文獻報道，在腎癌細胞中抑制EZH2 使細胞阻滯在Gl 期[18]，上調(diào)EZH2 使HeLa 細胞S 期延長[17]，表明EZH2 對不同細胞的細胞周期的影響存在差異。

綜上所述，EZH2 蛋白在NSCLC 對順鉑的耐藥中發(fā)揮作用，抑制EZH2 基因可以部分逆轉(zhuǎn)NSCLC對順鉑的耐藥性，其參與耐藥的機制可能與抑制細胞凋亡、促進細胞周期進展、增強細胞增殖能力有關(guān)。