條石鯛精子誘導(dǎo)大黃魚減數(shù)分裂雌核發(fā)育

陳睿毅，徐冬冬，樓 寶，張琴星，孟祥磊

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江三門 317100；3.嵊泗縣海洋與漁業(yè)局，浙江舟山 202450）

大黃魚Larimichthys crocea，隸屬鱸形目，石首魚科，黃魚屬。其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類，據(jù)不完全統(tǒng)計[1]，2018 年大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)20.35 萬t，是我國8 大優(yōu)勢出口水產(chǎn)品之一，是一條產(chǎn)業(yè)價值百億的特色魚。與半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis[2]和黃姑魚Nibea albiflora[3]等類似，大黃魚也存在著雌性生長快于雄性的現(xiàn)象[4]。因此，通過選育手段實現(xiàn)大黃魚全雌化養(yǎng)殖，可以縮短大黃魚養(yǎng)殖周期，提高經(jīng)濟(jì)效益。

人工雌核發(fā)育技術(shù)作為一種有效的性別控制方法已廣泛應(yīng)用于多種魚類的選育[5-7]。一般來說，雌核發(fā)育誘導(dǎo)中用于刺激卵子分裂的“激活源”主要分為“同源精子”和“異源精子”兩種。目前，在牙鲆Paralichthys olivaceus 雌核發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，利用同源精子誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得的子代中有1 尾牙鲆中存在父方基因表達(dá)的現(xiàn)象[8]，而利用真鯛Pagrus major 精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育[9]，RAPD 分析結(jié)果顯示，真鯛精子的遺傳信息未在雌核發(fā)育二倍體的電泳圖中檢出。同源精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育，由于不能保證精子被百分之百的滅活，存在精子遺傳物質(zhì)殘留于雌核發(fā)育胚胎中的可能性，還存在雌核發(fā)育后代中混入正常二倍體的現(xiàn)象。而利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的異源精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育則可有效避免精子滅活不徹底形成正常受精的可能性，存活下來的即為雌核發(fā)育二倍體，這在一定程度上也表明異源精子在誘導(dǎo)雌核發(fā)育方面擁有更高的準(zhǔn)確率。大黃魚同源精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究在國內(nèi)已有報道，吳清明等[10]采用靜水壓抑制第一次卵裂的方法成功獲得了雙單倍體大黃魚，4 個微衛(wèi)星檢測表明6.67%的子代含有父本特有等位基因。苗亮等[11]和汪倩鳳等[12]則分別利用未經(jīng)滅活的鮸魚精子Miichthys miiuy 和滅活的黃姑魚精子誘導(dǎo)了大黃魚減數(shù)分裂雌核發(fā)育，結(jié)果表明兩者均能成功激活卵子并發(fā)育成仔魚。

本研究在參考前人相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，利用與大黃魚親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的條石鯛Oplegnathus fasciatus 精子作為激活源，優(yōu)化了條石鯛精子激活大黃魚卵子及誘導(dǎo)其雌核發(fā)育的相關(guān)參數(shù)，并用流式細(xì)胞儀檢測了雌核發(fā)育群體的二倍性，用組織切片的方法證明了雌核發(fā)育大黃魚的全雌性。

1 材料與方法

1.1 精卵的獲得

實驗用大黃魚親魚來自臺州市大陳島養(yǎng)殖有限公司，2017 年4 月初從大陳島網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地運輸至舟山，在室內(nèi)進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化4 周，水溫升至20 ℃后開始實驗。從親魚群體中（511.74±76.22 g）挑選體格健壯，性腺發(fā)育良好的雌性大黃魚注射促黃體素釋放激素A3（LHRH-A3），劑量為8.0～10.0 μg·kg-1，30～36 h 后輕輕擠壓大黃魚的腹部獲得卵子，置于燒杯中。實驗用條石鯛雄魚為來自浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場培育的3 齡親體（323.12±26.32 g），條石鯛雄魚無需催產(chǎn)，輕輕擠壓雄魚腹部即可獲得精子。采集的精子和卵子常溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 精子的紫外線滅活

精子滅活所用紫外燈箱中有2 支15 W 的紫外燈（Philips，G15T8），滅活前提前預(yù)熱15 min。將條石鯛精子用常溫Ringer 氏液稀釋40 倍，取稀釋后的精液5 mL 置于直徑9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿置于距燈管垂直距離20 cm 處進(jìn)行滅活。采用紫外輻照計（UV-B（254），北京師范大學(xué)光電儀器廠）測量此處輻射強(qiáng)度為1 330～1 350 μW·cm-2。為了篩選最佳的照射劑量，分別設(shè)定紫外時間為0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、120 s、180 s 和240 s。將不同照射時間的精液分別取200 μL 與1 mL 的大黃魚卵子混合，常溫海水激活后置于1 L 燒杯中孵化，孵化溫度為21～22 ℃。以上處理均做3 個平行實驗，統(tǒng)計其孵化率，得到最佳精子滅活時間。

1.3 人工授精與冷休克

參考許建和等[13]同源精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育的方法，略作修改，具體步驟為：利用滅活后的條石鯛精子對大黃魚卵子進(jìn)行人工授精，授精2 min 后將受精卵置于3 ℃海水中處理10 min，然后21～22 ℃水溫下孵化。另設(shè)單倍體對照組（滅活精子授精，未經(jīng)冷休克）和正常對照組（鮮精授精），實驗組和對照組均做了3 個平行家系。

1.4 胚胎發(fā)育觀察及倍性檢測

在受精卵孵化期間，采用NIKON-MSZ800 解剖鏡觀察胚胎發(fā)育并拍照。仔魚出膜后，隨機(jī)挑選單倍體、正常二倍體和雌核發(fā)育二倍體各30 尾，采用流式細(xì)胞儀Ploidy Analyzer （BD FACSCalibur，American）進(jìn)行分析測定。

1.5 雌核發(fā)育二倍體的性腺切片觀察

雌核發(fā)育大黃魚4 月齡時，隨機(jī)挑選30 尾測量其體長和體質(zhì)量，采用麻醉劑MS222 麻醉后解剖取性腺，固定于波恩液中；然后將樣品進(jìn)行石蠟包埋、組織切片和蘇木素-伊紅染色。采用Olympus MS800 顯微鏡對組織切片進(jìn)行觀察，統(tǒng)計性別比例。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗中受精率和孵化率的統(tǒng)計方法為：受精率為發(fā)育至原腸期的受精卵數(shù)與總授精卵數(shù)之比；孵化率為孵化個體數(shù)與原腸期正常胚胎數(shù)之比。用SPSS19.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線滅活

條石鯛精子在不同紫外線強(qiáng)度滅活后，經(jīng)其授精的大黃魚卵子表現(xiàn)出不同的孵化率（圖1）。從圖1 可知，未經(jīng)滅活的條石鯛精子其孵化率為63.12%±2.78%；當(dāng)其在紫外線下照射5 s 之后，孵化率降至33.18%±2.34%；25 s 時孵化率達(dá)到最低值為18.58%±3.23%。之后隨著滅活時間的延長其孵化率逐漸升高，至60 s 時最高，為47.39%±2.24%；60 s之后孵化率又逐漸降低，呈現(xiàn)出顯著的Hertwig 效應(yīng)。結(jié)果表明，條石鯛精子紫外線滅活的最佳時間為60 s，此時累積輻射量為80 mJ·cm-2。

2.2 受精率和孵化率

大黃魚正常對照組的受精率和孵化率分別為67.32%±8.39%和73.18%±4.21%，顯著高于實驗組的39.36%±3.47%和34.28%±3.12%（P＜0.01）（表1）。

圖1 紫外線照射時間對大黃魚孵化率的影響Fig.1 The influence of UV irradiation duration on the hatching rate of L.crocea

表1 對照組和實驗組的受精率和孵化率Tab.1 The fertilization rate and incubation rate of control and experimental group

2.3 胚胎發(fā)育觀察及倍性檢測

未經(jīng)冷休克處理的受精卵孵化后均為畸形，表現(xiàn)出顯著的“單倍體綜合征”，且出膜后全部死亡（圖2）。倍性檢測結(jié)果顯示，雌核發(fā)育二倍體和正常二倍體的DNA 相對含量均為200，而單倍體的DNA 含量為100（圖2）。說明條石鯛精子中的DNA 未進(jìn)入雌核發(fā)育大黃魚的基因組；同時還表明通過冷休克的方式可以實現(xiàn)使大黃魚染色體數(shù)目加倍的目的。

圖2 大黃魚雌核發(fā)育二倍體（a）、正常二倍體（b）和單倍體（c）（人工授精50 h 后，孵化水溫21 ℃）Fig.2 External morphologies and patterns of gynogenetic diploid，diploid control and haploid larvae of L.crocea （50 h，T=21 ℃）

2.4 性腺組織切片檢測

4 月齡時大黃魚平均體長7.88±0.57 cm，平均體質(zhì)量為8.32±0.63 g，30 尾雌核發(fā)育大黃魚性腺切片均能觀察到初級卵母細(xì)胞和卵巢腔，表明雌核發(fā)育大黃魚性腺發(fā)育為卵巢。

3 討論

圖3 4 月齡雌核發(fā)育大黃魚性腺組織切片F(xiàn)ig.3 Gonadal histology of gynogenetic large yellow croaker at 4 months of age

人工雌核發(fā)育可分為減數(shù)分裂雌核發(fā)育和有絲分裂雌核發(fā)育，前者通過抑制第二極體排出，后者則通過抑制第一次有絲分裂而使染色體加倍。但兩種方法均需要利用精子對卵子進(jìn)行激活，因此“激活源”的選擇對于雌核發(fā)育的成功率至關(guān)重要。有學(xué)者指出[15]，大多數(shù)屬間以上的雜交相容性都很低，大部分胚胎在孵化期前后陸續(xù)死亡，表現(xiàn)出極低的孵化率。條石鯛和大黃魚分屬不同科，相比于黃姑魚和鮸魚[11-12]，在遺傳進(jìn)化上條石鯛與大黃魚親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。實驗中發(fā)現(xiàn)，條石鯛和大黃魚的雜種雖然可以出膜，但在開口之前全部死亡，這樣即使有少量雄核的遺傳物質(zhì)未被完全滅活，個體也會在出膜后自然淘汰，避免了正常二倍體混入的可能。

精子的遺傳物質(zhì)的失活是影響雌核發(fā)育能否成功的關(guān)鍵因素[16]，但對于誘導(dǎo)雌核發(fā)育究竟是選擇同源精子還是異源精子，目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。有研究表明：同源精子成功誘導(dǎo)雌核發(fā)育所需紫外輻射劑量更高[12]，而使用異源精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育能顯著提高雌核發(fā)育子代成活率[17-18]。本研究中，將條石鯛精子用常溫Ringer 氏液稀釋40 倍后，置于紫外燈下進(jìn)行滅活，當(dāng)輻射強(qiáng)度為80 mJ·cm-2時，大黃魚受精率和孵化率最高。而汪倩鳳等[12]利用黃姑魚精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育，黃姑魚精子紫外滅活處理的最適劑量則為198 mJ·cm-2，另有研究表明[19]同源精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育，精子紫外滅活劑量在253～406 mJ·cm-2均能成功誘導(dǎo)，這些實驗結(jié)果與本研究存在較大差異，可能是因為本研究中精液滅活是在常溫下進(jìn)行，而上述其他研究則是在4 ℃下或冰面上進(jìn)行。精子的適宜紫外滅活劑量隨魚種類不同而存在較大差異，如條斑星鰈Verasper moseri 精子為40～45 mJ·cm-2[20]，大西洋鱈Gadus morhua 精子為221 mJ·cm-2[21]，斜帶石斑魚Epinephelus coioides 精子為518 mJ·cm-2[22]。同樣，精子保存液的種類也會對同種魚類精子的滅活劑量產(chǎn)生影響，如黃姑魚精子用不同的精子保存液稀釋后（Ringer 保存液和Hanks 保存液），其最適紫外滅活劑量分別為420 mJ·cm-2[23]和228 mJ·cm-2[24]，存在較大差異。此外，滅活時精液的溫度、精液的稀釋倍數(shù)和精液厚度等因素[25]，也會造成最適滅活劑量的差異。因此實際操作中，一方面可以通過顯微鏡觀察紫外線照射后精子的活力，另一方面還可以通過觀察雌核發(fā)育后代的孵化率來判斷最適的滅活劑量。

雌核發(fā)育的目的一般是為了獲得純系的單性別群體，但由于人為處理并不能使精子100%滅活，因而必須有充分的證據(jù)證明精子在雌核發(fā)育過程中沒有提供遺傳物質(zhì)。本研究中，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的條石鯛精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育，有效避免了精子滅活不徹底形成正常受精卵的可能性，存活下來的個體經(jīng)倍性檢測證實為二倍體，性腺組織切片也證明了它們的全雌性，這表明條石鯛精子可以成功誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育，是一種合適的“激活源”。魚類的性別決定機(jī)制多樣而復(fù)雜，雌核發(fā)育可以作為一種重要的手段用以判別魚類的性別決定機(jī)制[26-27]。雌核發(fā)育個體所有遺傳物質(zhì)均來自于母本，理論上，XX/XY 性別決定機(jī)制的個體雌核發(fā)育后代全部為XX 個體，即雌性個體。本研究中，利用性腺組織切片的方法來鑒定大黃魚雌核發(fā)育群體的性別，結(jié)果表明其100%為雌性，這也證明大黃魚性別為雌性配子同型性別決定型，即為XX/XY 決定型。

綜上，本實驗研究表明，條石鯛精子是誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育的一種合適的激活源，水溫3 ℃下，授精2 min 后，冷休克10 min，可以獲得大黃魚減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體，并且雌核發(fā)育群體具有全雌性，這也從側(cè)面表明大黃魚的性別決定為XX/XY。