大型海藻對石油烴的降解技術(shù)研究

徐 丹，郭遠明，李鐵軍，張玉榮

（1.浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

石油類是成分十分復雜的混合物，含有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等多種難以降解的有害物質(zhì)[1-2]。當海水被石油污染時，會影響海洋生物的攝食、生長和繁殖，改變魚類的洄游路線，沾污漁具和漁獲物，影響水產(chǎn)品質(zhì)量，最終危害人體健康[3-5]。隨著石油及其產(chǎn)品在開采、煉制、貯運和使用過程中進入海洋，通過各種途徑進入海洋的石油類化合物總量不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，從20 世紀70 年代到21 世紀初，全球大約有56.59×104t 石油排入海洋中，我國每年約10×104t 石油直接排入近海[6]，大量石油入海導致海洋生物多樣性指數(shù)降低，海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失衡，漁業(yè)資源的質(zhì)量和產(chǎn)量下降嚴重[7-8]，1971-2011 年，我國50 t 以上海洋溢油事故共發(fā)生81 起，溢油總量為49 667 t，污染物種類主要為燃油、原油和柴油?！笆の濉逼陂g我國石油需求量仍然巨大，沿海石油運輸量也將日益增加，海洋溢油風險發(fā)生概率逐漸增大。海洋溢油事故發(fā)生后，其影響范圍和程度往往是巨大的，通常會導致溢油事故發(fā)生地周邊海域生態(tài)環(huán)境和漁業(yè)資源受到嚴重破壞，造成巨大的經(jīng)濟損失[9]。因此，開展入海石油污染物的修復治理研究對保護海洋生態(tài)環(huán)境和促進海洋經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

海洋生物修復技術(shù)是指利用特定的生物（植物、微生物或其他動物）吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解環(huán)境污染物，使環(huán)境中的有害污染物通過降解或其他途徑得以去除，實現(xiàn)環(huán)境凈化、生態(tài)效應恢復的生物措施。與傳統(tǒng)的物理、化學處理方法相比，具有現(xiàn)場修復、不產(chǎn)生二次污染、時間短、經(jīng)費低、對人體健康和環(huán)境影響小等優(yōu)點[10]，在重金屬污染、有機物污染、石油污染等幾種主要海洋污染中得到廣泛的研究和應用。近年來，國內(nèi)外在微生物和微藻對海洋石油污染的生物修復研究方面取得了較多成果[11-14]，但未見大型海藻對石油烴的降解技術(shù)研究，本文初步探討了海帶Laminaria japonica、裙帶菜Undaria pinnatifida、帶形蜈蚣藻Grateloupia turuturu 和孔石莼Ulva lactuca 等4 種大型海藻對石油烴的降解效果及石油烴對大型海藻超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的影響，篩選出對石油污染具有較好去除效果的大型藻類，為利用大型海藻治理海洋石油污染提供技術(shù)依據(jù)，拓展海洋石油污染治理的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

帶形蜈蚣藻購買于普陀區(qū)東河市場，孔石莼采集于舟山海域，海帶和裙帶菜采集于嵊泗枸杞島，運回實驗室經(jīng)海水反復清洗去除泥沙及雜質(zhì)后，置于溫度12±1 ℃、鹽度27、pH 7.8 水箱中培養(yǎng)，實驗室暫養(yǎng)5 d后，選取生長健壯、形態(tài)較一致的藻體用于實驗。

1.2 石油烴母液

在避光條件下，室溫下按照1：9 的體積比將經(jīng)過過濾滅菌的海水與加油站購買的0#柴油混合，之后經(jīng)超聲震蕩器處理6 h，然后將混合液倒入分液漏斗中靜置5 h，最后將分離出的石油烴母液于4 ℃避光保存，石油烴母液濃度的測定按照海洋監(jiān)測規(guī)范（GB17378.4-2007）中石油醚萃取熒光分光光度法進行，實驗時按設(shè)置濃度對母液進行稀釋。

1.3 實驗方法

實驗設(shè)置0.8、1.7、2.6、3.6、4.5 mg·L-15 個濃度，以飽和石油烴作為對照組。實驗在容積為2 L 的燒杯中進行，每個燒杯實驗用水體積為1.6 L，每個燒杯中放入大型海藻10.0 g 左右。每個實驗處理組設(shè)置3 個重復，實驗周期5 d，于實驗的第1、2、3、4、5 d 取3 個平行樣測定超氧化物歧化酶（SOD），實驗結(jié)束后取培養(yǎng)水測量石油烴含量和大型藻濕重。

1.4 SOD 的測定

選擇新鮮藻體取樣0.3 g，經(jīng)液氮研磨成勻漿狀，然后加入提取液5 mL （pH 7.0、50 mmol·L-1H3PO4緩沖液；1% PVP 0.1%；Triton X-100）[15]，離心取上清液作為待測溶液。SOD 的測定使用南京建成生物工程研究所試劑盒，采用羥胺法測定SOD 活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SOD 測定結(jié)果以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)處理軟件分析實驗數(shù)據(jù)，石油烴脅迫引起的顯著差異用單因素方差分析法（ANOVA） 分析，當顯著性水平P＜0.05 時為顯著性差異，P＜0.01 時為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大型海藻濕重變化

大型海藻在不同濃度石油烴中生長濕重變化結(jié)果如表1?？梢钥闯觯蛯φ障啾?，在1.7 mg·L-1濃度以下，海帶和裙帶菜濕重都有一定程度的增長，葉片健康無腐爛，1.7 mg·L-1以上增長率為負值且逐漸降低，葉片有腐爛現(xiàn)象。全部濃度石油烴中帶形蜈蚣藻和孔石莼濕重均低于對照，隨著石油烴濃度的升高，濕重降低程度越高，葉片損傷越嚴重。綜上可知，海帶和裙帶菜在低于1.7 mg·L-1的石油烴中生長良好。

表1 大型海藻在不同濃度石油烴中濕重增長率Tab.1 The wet weight growth rate of macroalgae in WAF with different concentrations

2.2 大型海藻對不同濃度石油烴的降解率

大型海藻對不同濃度石油烴的降解率如表2?？梢钥闯?，除2.6 mg·L-1處理組的海帶、裙帶菜外，海帶、裙帶菜、帶形蜈蚣藻和孔石莼等4 種大型海藻對石油烴的降解率均隨濃度的增加而逐漸降低，其中海帶和裙帶菜對低于1.7 mg·L-1的石油烴具有較好的降解效果，海帶對石油烴的降解率為76.3%～81.3%，裙帶菜對石油烴的降解率為82.2%～87.5%，海帶和裙帶菜對石油烴的降解效果遠好于帶形蜈蚣藻和孔石莼。

表2 大型海藻對不同濃度石油烴的降解率Tab.2 The degradation rate of WAF with different concentrations of macroalgae

2.3 不同濃度石油烴對大型海藻SOD 活性的影響

2.3.1 不同濃度石油烴對海帶SOD 活性的影響

海帶SOD 的酶活性結(jié)果如圖1 所示。低濃度（0.8、1.7 mg·L-1）各處理組的SOD 活性在實驗前4d 內(nèi)均極顯著高于對照組（P＜0.01），至5 d 時0.8 mg·L-1處理組基本恢復至最初水平，1.7 mg·L-1處理組仍極顯著高于對照組（P＜0.01）；中濃度（2.6 mg·L-1）處理組的SOD 活性在實驗1 d 時極顯著高于對照組（P＜0.01），2～5 d 時顯著高于對照組（P＜0.05）；高濃度3.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前2 d 內(nèi)顯著高于對照組（P＜0.05），3～5 d 時極顯著低于對照組（P＜0.01）。4.5mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前2 d 時與對照差不多，3～5 d時顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.3.2 不同濃度石油烴對裙帶菜SOD 活性的影響

裙帶菜SOD 的酶活性結(jié)果如圖2 所示，與不同濃度石油烴對海帶SOD 活性的影響相似。低濃度0.8 mg 處理組的SOD 活性在實驗前4 d 內(nèi)均顯著高于對照組（P＜0.05），低濃度1.7 mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前4 d 內(nèi)均極顯著高于對照組（P＜0.01），至5 d 時各處理組基本恢復至最初水平；中濃度2.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前3 d 時顯著高于對照組（P＜0.05），4～5 d 時極顯著高于對照組（P＜0.01）；高濃度3.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前2 d 時顯著高于對照組（P＜0.05），3 d 時與對照差不多，4～5 d 時極顯著低于對照組（P＜0.01）。高濃度4.5 mg·L-1處理組的SOD 活性在實驗前3 d時與對照差不多，4～5 d 時極顯著低于對照組（P＜0.01）。

圖1 海帶在不同濃度石油烴中培養(yǎng)后的SOD（U·mg-1prot）Fig.1 SOD of L.japonica cultivated in WAF with different concentrations

3 討論

圖2 裙帶菜在不同濃度石油烴中培養(yǎng)后的SOD（U·mg-1prot）Fig.2 SOD of U.pinnatifida cultivated in WAF with different concentrations

SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于微生物、植物、動物等各種生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，提高生物體抗氧化能力。在外界環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)氧自由基如超氧化合物陰離子自由基的產(chǎn)量會增加[16]。已有研究成果表明，當藻類受到外界污染脅迫時，會破壞細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡，導致自由基累積，加劇細胞膜脂過氧化[17]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度的石油烴脅迫對藻類SOD 活性的影響不同，低濃度（≤1.7 mg·L-1）脅迫下前4 d 對海帶、裙帶菜的SOD 活性均有明顯的促進作用，而隨著處理時間的延長，至5d 時SOD 活性基本恢復到對照組水平；中濃度（2.6 mg·L-1）脅迫下對海帶、裙帶菜的SOD 活性均有明顯的促進作用，5 d 時仍顯著高于對照組；高濃度（≥3.6 mg·L-1）脅迫下4～5 d 時SOD 活性處于較低水平，顯著低于對照組。原因可能是：在低濃度石油烴脅迫下，海帶、裙帶菜對外來干擾做出應急防御，提高了藻細胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生速率，從而快速激發(fā)更多的SOD 來清除活性氧，將超氧化物歧化為過氧化氫，隨著脅迫時間的增加，細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除達到平衡，SOD 活性基本恢復至最初水平。在中濃度石油烴脅迫下，藻細胞內(nèi)活性氧代謝機制的平衡被打破，導致活性氧在藻細胞內(nèi)大量累積，顯著提高了SOD 活性，對藻體起到一定的保護作用。在高濃度石油烴脅迫下，4～5 d 時海帶、裙帶菜體內(nèi)的SOD 活性反而下降，可能因石油烴降解率較低，藻體的SOD 活性下降來避免自身損傷或者生物體已經(jīng)受到脅迫損傷導致SOD 下降，具體原因還需要進一步研究。

3 結(jié)論

（1）海帶和裙帶菜在低濃度（≤1.7 mg·L-1）的石油烴中生長良好，并且對石油烴具有較好的降解效果，海帶對石油烴的降解率為76.3%～81.3%，裙帶菜對石油烴的降解率為82.2%～87.5%。

（2）在低濃度（≤1.7 mg·L-1）時石油烴雖然會導致海帶和裙帶菜體內(nèi)的SOD 活性升高，但最終會恢復到正常范圍，是一種可逆的損傷，高濃度的石油烴會對海帶和裙帶菜造成不可逆的生物損傷。

（3）海帶和裙帶菜可作為低濃度（≤1.7 mg·L-1）石油污染的降解生物，具有一定的應用價值。