對GB 8538-216《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)的研究與改進(jìn)

黃薇臻

摘 要：以中國檢科院測試評價(jià)中心（ACAS）組織的礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測能力驗(yàn)證、測量審核為例，實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》，實(shí)驗(yàn)過程濾膜上的菌落在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）經(jīng)24 h厭氧環(huán)境培養(yǎng)后黑色菌落不明顯，甚至不生長黑色菌落影響后續(xù)確認(rèn)性實(shí)驗(yàn)，以及確證性實(shí)驗(yàn)中含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴烈發(fā)酵”實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，針對此現(xiàn)象進(jìn)行研究與改進(jìn)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌;檢驗(yàn);改進(jìn)

Abstract：Taking the testing ability verification and measurement audit of clostridium perfringens in mineral water organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Sciences （ACAS） as an example， the test used standard GB 8538-2016 Inspection Method for Drinking Natural Mineral Water in National Standard for Food Safety”. In the process of the experiment， black colonies on the filter membrane were not obvious after 24h anaerobic culture of sulfite - polymyxin - sulfadiazine （SPS）. And there was no black colonies which influenced subsequent confirmatory experiments. The “violent fermentation” of iron-containing milk medium was also not obvious in the confirmatory experiment. Research and improvement were performed based on this.

Key words：Clostridium perfringens; Testing; Improvement

中圖分類號：R123.1

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎常見的病原菌，該菌能引起氣性壞疽和食物中毒。由該菌引發(fā)的食物中毒為食入被大量（108～109）細(xì)菌繁殖體污染的食物（主要為肉類食物）而引起，潛伏期大約10 h，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹脹、水樣腹瀉，無熱、無惡心嘔吐現(xiàn)象，1～2 d可自愈，如不進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查常難確診。

針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性GB 8537-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》微生物限度規(guī)定n=5，c=0，m=0 CFU/50 mL，即抽樣5份，檢驗(yàn)5份，不得檢出。根據(jù)平常監(jiān)督抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測檢驗(yàn)，檢出率很低，并且這是計(jì)數(shù)定量類型檢驗(yàn)，所以很難發(fā)現(xiàn)GB 8538-2016檢驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)過程中的問題。參加了中國檢科院測試評價(jià)中心（ACAS）組織的礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測能力驗(yàn)證，并且同時進(jìn)行陽性菌驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)過程中，陽性菌和能力驗(yàn)證樣品在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）均不顯黑色，但GB 8538-2016規(guī)定挑取SPS平板上過濾法過濾水樣后生長的可疑黑色菌落3～5個，分別接種FT培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)確證性實(shí)驗(yàn)。所以產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS平板上不顯現(xiàn)黑色，則會被定義為非疑似菌落，會導(dǎo)致漏檢，不能真實(shí)反映樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在情況。并且確認(rèn)性實(shí)驗(yàn)中，GB 8538-2016規(guī)定取生長旺盛的FT培養(yǎng)液1 mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象發(fā)生，在5 h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。經(jīng)過實(shí)際試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)即使陽性菌也不能5 h內(nèi)產(chǎn)生“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，以此為根據(jù)很容易出假陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為解決這些問題，本文對標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了研究與改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種，編號：ATCC 13124。經(jīng)復(fù)蘇純化后，VITEK鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌株。

1.1.2 能力驗(yàn)證樣品

總編號：ACAS-PT738，分為兩個樣品：19-K292（有100稀釋級以內(nèi)的菌落）、19-G591（有100～200稀釋級以內(nèi)菌落）。

1.1.3 測量審核樣品

總編號：ACAS-MA20，分為兩個樣品：MA20-A522、

MA20-A843

1.1.4 主要儀器

高壓滅菌鍋（型號：YXQ-LS-75G，上海博迅）;生物安全柜（型號：AC2-6S1，新加坡藝思高）;培養(yǎng)箱（型號：BSP-250，上海博迅）。

1.1.5 主要試劑耗材

亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂、2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT）、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)液、含鐵牛奶培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試劑、乳糖-明膠培養(yǎng)基、0.1% 蛋白胨水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 能力驗(yàn)證樣品按GB 8538-2016試驗(yàn)

按能力驗(yàn)證樣品說明復(fù)原520 mL水樣，等同于一個完整待測礦泉水水樣。按GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》用0.1%蛋白胨水稀釋4個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌模擬樣品GB 8538-2016試驗(yàn)

陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌復(fù)蘇后直接吸取含菌復(fù)蘇液1 mL加入520 mL滅菌水模擬含菌樣品，等同于一個完整待測礦泉水樣。按GB 8538-2016用0.1%蛋白胨水稀釋7個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂培養(yǎng)基平板和TSC瓊脂平板上，并在濾膜上鋪一層相同于底層的培養(yǎng)基均勻覆蓋整個表面，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.2.3 測量審核樣品按GB 8538-2016試驗(yàn)

按能力驗(yàn)證樣品說明復(fù)原520 mL水樣，等同于一個完整待測礦泉水水樣。按GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》用0.1%蛋白胨水稀釋4個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂和培養(yǎng)基平板和TSC瓊脂平板上[2]，并在濾膜上鋪一層相同于底層的培養(yǎng)基均勻覆蓋整個表面，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 能力驗(yàn)證樣品按GB 8538-2016試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1知，在4個稀釋級中，均無發(fā)現(xiàn)黑色菌落，與檢驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中“產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS瓊脂上顯黑色[1]”不一致，在平板上，肉眼可見僅有灰白色大顆菌落和黃色小顆菌落。同時用陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌畫線SPS瓊脂平板，也均無黑色菌落（見圖2）。再次復(fù)試實(shí)驗(yàn)，同時也用GB 4789.13-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》中使用的TSC平板進(jìn)行試驗(yàn)，因?qū)嶒?yàn)原液放入冰箱4 ℃保存，已經(jīng)檢測不出菌落，查詢資料產(chǎn)氣莢膜梭菌是厭氧噬熱菌，放入冰箱凍存極有可能已經(jīng)失活。所以如果按照GB 8538-2016實(shí)驗(yàn)，在此步驟中，即使樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌，實(shí)際按照此方法試驗(yàn)不出黑色菌落，則會被定義為非疑似菌落而不繼續(xù)進(jìn)行鑒定，最后產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌模擬樣品GB 8538-2016試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖3知，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各稀釋級均能產(chǎn)生出黑色菌落，無灰白色菌落產(chǎn)生，除了濃度較高在濾膜上黑色菌落疊加而邊緣模糊。挑取黑色菌落進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定，陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌也接種FT培養(yǎng)基作為陽性對照，經(jīng)試驗(yàn)所有生化鑒定均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化反應(yīng)除牛奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，按GB 8538-2016要求“取接種過黑色菌落生長旺盛的FT接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象發(fā)生，在5 h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性”，試驗(yàn)結(jié)果不管是目標(biāo)菌還是陽性菌并不能在規(guī)定的5 h內(nèi)有“暴烈發(fā)酵”的現(xiàn)象，分析可能原因?yàn)橹苯咏臃N進(jìn)含鐵牛乳培養(yǎng)基試管，菌液在上表面，而產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧菌，菌液在表面與空氣接觸會影響牛奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，把菌液通過移液管插入生長旺盛的FT底部接種，這樣可以排除空氣接觸的影響，經(jīng)過試驗(yàn)結(jié)果還是不管是目標(biāo)菌還是陽性菌并不能在規(guī)定的5 h

內(nèi)有“暴烈發(fā)酵”的現(xiàn)象，分析原因可能是目標(biāo)菌即使在FT中經(jīng)過24 h培養(yǎng)活力仍然不足以是含鐵牛乳在5 h內(nèi)“暴烈發(fā)酵”，標(biāo)準(zhǔn)中可能對牛奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的時間要求過于苛刻。為了證明此觀點(diǎn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用能力驗(yàn)證中的雜菌（非產(chǎn)氣莢膜梭菌）接種

2支含鐵牛乳培養(yǎng)基、黑色菌落目標(biāo)菌插入底部接種

5支、表面接種5支，產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照菌底部接種5支，表面接種5支觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在水浴培養(yǎng)5 h仍沒有任何一支含鐵牛乳培養(yǎng)基產(chǎn)生“暴烈發(fā)酵”的現(xiàn)象，只能繼續(xù)水浴培養(yǎng)18 h，結(jié)果為：含鐵牛乳培養(yǎng)基接種雜菌的2支均無現(xiàn)象;目標(biāo)菌落表面接種的5支中3支產(chǎn)生“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，插入底部接種的5支均產(chǎn)生了“暴烈發(fā)酵”的現(xiàn)象;產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌表面接種的5支中4支產(chǎn)生“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，插入底部接種的5支均產(chǎn)生了“暴烈發(fā)酵”的現(xiàn)象。水浴培養(yǎng)到24 h，結(jié)果并沒有變化，繼續(xù)培養(yǎng)到48 h，結(jié)果仍然沒有變化。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”實(shí)驗(yàn)如果按國家標(biāo)準(zhǔn)的要求46 ℃水浴培養(yǎng)，

5 h內(nèi)不發(fā)酵為陰性，則會產(chǎn)生因陽性菌活力不足不能使含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”報(bào)告假陰性結(jié)果，所以應(yīng)對GB 8538-2016進(jìn)行改進(jìn)：取接種過黑色菌落生長旺盛的FT插入底部接種含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)18 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象發(fā)生，在24 h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。

2.3 測量審核樣品按GB 8538-2016試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖4知，試驗(yàn)結(jié)果因?yàn)楦采w了表面已經(jīng)均能生長黑色菌落，無灰白色菌落產(chǎn)生，但在SPS瓊脂平板的濾膜上，菌落灰黑色，菌落整顆比較小且邊緣模糊并且有菌落連片生長黏連一起，只有計(jì)數(shù)兩個1∶10稀釋度的SPS平板分別為10和15（見圖5、6），而在TSC瓊脂平板菌落呈炭黑色，菌落邊緣清晰整齊，分布較均勻在濾膜上，計(jì)數(shù)兩個1∶10稀釋度的TSC平板分別為11和12（見圖7、8）。按GB 8538-2016要求挑取黑色菌落進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定，SPS平板濾膜上的菌落比較模糊，黏連一片比較難挑取，而TSC平板濾膜上菌落清晰，扁圓狀貼在濾膜和覆蓋的培養(yǎng)基之間，容易挑取，甚至可以整顆挑出。同時挑取SPS平板上和TSC平板的黑色菌落進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定，陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌也接種FT培養(yǎng)基作為陽性對照，經(jīng)試驗(yàn)所有生化鑒定均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化反應(yīng)，按“插入底部接種含鐵牛乳，水浴培養(yǎng)18 h”的改進(jìn)方式進(jìn)行含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”實(shí)驗(yàn)，挑取SPS平板和TSC平板上的黑色菌落各

10顆，陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌平行接種做對照，結(jié)果TSC平板黑色菌落接種的含鐵牛乳產(chǎn)生“暴烈發(fā)酵”有9支（見圖9），SPS平板黑色菌落接種的有6支（見圖10）。通過實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)相較于GB 8538-2016推薦使用的SPS培養(yǎng)基，GB 4789.13-2012中計(jì)數(shù)使用的TSC培養(yǎng)基對礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌在濾膜上顯現(xiàn)黑色更具有明顯性和特異性。SPS培養(yǎng)基的原理在于產(chǎn)氣莢膜梭菌具有還原亞硫酸鹽的能力，把SPS培養(yǎng)基中的亞硫酸鹽還原為硫化物，再與檸檬酸鐵銨反應(yīng)產(chǎn)生黑色沉淀，使菌落呈黑色[3]。而TSC培養(yǎng)基是