金蓮花不同溶劑提取物抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的譜-效關(guān)系研究

南敏倫 孫琦 楊振 司學(xué)玲 馬春霞 白雪 赫玉芳

摘 要 目的：研究金蓮花11種不同溶劑提取物抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的譜-效關(guān)系。方法：利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立金蓮花11種不同溶劑提取物的指紋圖譜，通過與對(duì)照品、文獻(xiàn)信息比對(duì)，指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)的化合物。采用MTT法檢測金蓮花11種不同溶劑提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷大鼠心肌細(xì)胞H9c2存活率的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細(xì)胞中丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平和上清液中乳酸脫氫酶（LDH）含量。通過灰色關(guān)聯(lián)度分析法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）聯(lián)合分析共有峰對(duì)應(yīng)成分與抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷（藥效）的譜-效關(guān)系。結(jié)果：金蓮花11種不同溶劑提取物的指紋圖譜中有22個(gè)共有峰，指認(rèn)出22個(gè)化合物。與缺氧/復(fù)氧損傷組比較，缺氧/復(fù)氧+S1～S6、S9、S10組細(xì)胞的存活率均顯著升高，MDA含量、ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）;缺氧/復(fù)氧+S8組細(xì)胞的ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）。22個(gè)化合物與藥效的GRA關(guān)聯(lián)度均大于0.8;除峰1、2、7、13、14、21外，其余峰對(duì)應(yīng)化合物與藥效的PLS分析回歸系數(shù)均大于0（即成正相關(guān)）;貢獻(xiàn)排名前9位的共有峰均為峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。結(jié)論：葒草苷（峰6）、牡荊苷（峰11）、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金絲桃苷（峰12）、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁?；?葒草苷（峰15）可能是金蓮花抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的主要成分。

關(guān)鍵詞 金蓮花;心肌細(xì)胞H9c2;缺氧/復(fù)氧損傷;譜-效關(guān)系;灰色關(guān)聯(lián)度分析法;偏最小二乘法

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）18-2219-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.08

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study spectrum-effect relationship of 11 different solvent extracts from Trollius chinensis against hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte. METHODS： HPLC-MS/MS method was used to establish the fingerprints of 11 different solvent extracts from T. chinensis， the compounds corresponding to the common peaks were identified by comparing with the substance control and literature information. MTT assay was used to detect the effects of 11 different solvent extracts from T. chinensis on the survival rate of rat myocardial H9c2 cells injured by hypoxia/reoxygenation. The MDA content， ROS level in cells and LDH content in the supernatant were detected by ELISA. GRA and PLS method were used to analyze the spectrum-effect relationship between the compounds corresponding to common peak and anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte （drug effect）. RESULTS： There were 22 common peaks in 11 different solvent extracts from T. chinensis， and 22 compounds were identified. Compared with hypoxia/reoxygenation injury group， survival rate of hypoxia/reoxygenation injury+S1-S6，S9 and S10 groups were increased significantly， while MDA content， ROS level and LDH content were decreased significantly （P<0.05）; ROS level and LDH content of hypoxia/reoxygenation injury+S8 group were decreased significantly （P<0.05）. The r of GRA analysis of 22 compounds with drug effects were all higher than 0.8. Except for peaks 1， 2， 7， 13， 14 and 21， r of PLS analysis of rest peaks with drug effects were higher than 0（being positive correlation）. Top 9 common peaks in the list of contribution rate were peak 6>11>4>5>8>9>12>10>15. CONCLUSIONS： Orientin （peak 6），vitexin （peak 11）， orientin-2″-O-β-L-galacto- pyranosl （peak 4）， orientin-2″-O-β-D-Pyrine xylosides （peak 5）， quercetin-3-O-glucopyranoside （peak 8）， vitexin-2″-O-β-L-galactoside （peak 9）， hyperoside （peak 12）， vitexin-2″-O-β-D-pyrine xylosides （peak 10）， 2″-O-（2[″][′]- methylbutyry-loxy）-orientin （peak 15） may be the main components of anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocytes.

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以葒草苷峰（峰6）為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.22%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.33%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取金蓮花藥材粉末100 mg，共6份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（編號(hào)：S3），再按“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以葒草苷峰（峰6）為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.38%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.02%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 指紋圖譜生成及特征峰確認(rèn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備金蓮花11種提取物的供試品溶液，再按“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，圖譜間距為20 mV，通過多點(diǎn)校正及自動(dòng)匹配生成金蓮花11種提取物的疊加指紋圖譜，結(jié)果見圖1。由于S3圖譜吸收信號(hào)較強(qiáng)、峰形明顯、穩(wěn)定性較好，故選擇S3樣品的圖譜作為參照?qǐng)D譜。依據(jù)各色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，通過與對(duì)照品、文獻(xiàn)信息[3，7-13]比對(duì)，指認(rèn)金蓮花中共有峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。結(jié)果，金蓮花11種提取物指紋圖譜中有共有峰22個(gè)，化學(xué)成分的指認(rèn)結(jié)果見表1。

2.2 金蓮花提取物對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，并取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 分組與處理 將對(duì)數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞分為13組，分別為正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+各提取物（S1～S11）組。正常對(duì)照組細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 h;缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞用無糖、無血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、95%N2條件下培養(yǎng)3 h后，再按正常對(duì)照組條件培養(yǎng)3 h;缺氧/復(fù)氧+各提取物組細(xì)胞先分別用0.1 ?g/L（按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，以提取物質(zhì)量計(jì)）的S1～S11預(yù)處理30 min后，再按照缺氧/復(fù)氧組條件培養(yǎng)。

2.2.3 H9c2細(xì)胞存活率檢測 采用MTT法檢測。將H9c2細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分組、處理后，分別加入MTT試劑100 μL，于37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 100 μL，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值，以不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為空白組，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組OD值/空白組OD值）×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.4 H9c2細(xì)胞中MDA含量、ROS水平和上清液中LDH含量檢測 采用ELISA法檢測。將H9c2細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分組、處理后，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞中MDA含量和ROS水平以及上清液中LDH含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞的存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的檢測結(jié)果見表2。

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞的存活率顯著降低，MDA含量、ROS水平、LDH含量均顯著升高（P<0.05）;與缺氧/復(fù)氧組比較，除缺氧/復(fù)氧+S7組、缺氧/復(fù)氧+S8組、缺氧/復(fù)氧+S11組外其余各組細(xì)胞的存活率均顯著升高，MDA含量均顯著降低（P<0.05）;除缺氧/復(fù)氧+S7組、缺氧/復(fù)氧+S11組外其余各組細(xì)胞的ROS水平、LDH含量均顯著降低（P<0.05）。

2.3 金蓮花化學(xué)成分與抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的譜-效分析

2.3.1 GRA 利用DPS-3.01軟件，根據(jù)細(xì)胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量計(jì)算金蓮花抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的綜合活性數(shù)據(jù)，加權(quán)系數(shù)均為0.25。將共有峰峰面積數(shù)據(jù)與綜合活性數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化處理后，計(jì)算關(guān)聯(lián)度并排序，以評(píng)估各共有峰對(duì)藥效的貢獻(xiàn)，結(jié)果見表3。由表3可見，22個(gè)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與藥效的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，貢獻(xiàn)排名前9位的共有峰依次為峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。

2.3.2 PLS分析 利用SIMCA-11軟件，經(jīng)過多次提取主成分、多次迭代后，擬合出22個(gè)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分對(duì)抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的重要程度（即標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)）并排序，結(jié)果見表4。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，譜-效關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有多種方法，如相關(guān)分析法、GRA法、聚類分析法及PLS法[5]。本文應(yīng)用了GRA法和PLS法聯(lián)合分析了金銀花11種不同溶劑提取物中22個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)成分與抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷（藥效）的譜-效關(guān)系。GRA法主要分析兩種因素在發(fā)展過程中的關(guān)聯(lián)度大小，但其只能單獨(dú)考察各成分的重要性，并不能反映各成分對(duì)藥效的綜合作用[6-7]，故本文又采用了PLS法，通過擬合藥效與色譜峰之間的相關(guān)性，分析各成分對(duì)藥效的重要程度[14-15]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金蓮花中主要成分是黃酮類成分，此外還有少量的揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸、多糖、醇類、苷類等多種成分[9]。由于化學(xué)成分的多樣性，提取方法也較多，常用的提取方法有微波提取法、回流提取法、超聲提取法和超臨界流體提取法等[16-17]，回流提取能盡可能得提取有效成分[13]，故本研究選擇了回流提取法。此外，不同溶劑對(duì)不同類化學(xué)成分的溶解性不同，如揮發(fā)油易溶解于石油醚中，生物堿、醇類易溶解于三氯甲烷中，黃酮易溶解于高濃度乙醇或乙酸乙酯中，黃酮苷易溶解于低濃度乙醇或正丁醇中，多糖易溶解于水中，故為了盡可能地將各類成分均提取出來，本文選擇了“2.1.3”項(xiàng)下的提取方法，并得到了11種提取物。

本研究初步評(píng)價(jià)了金蓮花90%、80%、70%、60%、50%乙醇提取物以及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃提取物對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的主要指標(biāo)細(xì)胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的影響。研究結(jié)果表明，其中不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物以及乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物對(duì)各指標(biāo)的影響較為顯著。

本研究分析鑒定了金蓮花11種提取物中22個(gè)化學(xué)成分，通過譜-效分析確定了其中對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷起保護(hù)作用的主要化學(xué)成分可能為峰6、11、4、5、8、9、12、10、15，即葒草苷、牡荊苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷、金絲桃苷、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、2″-O-（2[″][′]-甲基丁?；?葒草苷，主要為黃酮類化合物，提示金蓮花的抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用可能與上述成分相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，葒草苷、牡荊苷等黃酮類成分為金蓮花的主要活性成分[12]，且上述成分均有一定的抗心肌缺血作用[4]，進(jìn)一步論證了本研究的可靠性。這對(duì)于闡明金蓮花抗心肌缺血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、金蓮花及其提取物多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立具有積極意義。

綜上所述，葒草苷（峰6）、牡荊苷（峰11）、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、葒草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金絲桃苷（峰12）、牡荊素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁?；?葒草苷（峰15）可能是金蓮花抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的主要成分。

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（收稿日期：2020-05-07 修回日期：2020-06-17）

（編輯：鄒麗娟）