以脾胃為中心的葛根相關(guān)配伍對(duì)糖尿病心肌病大鼠受損心肌線粒體的改善作用*

樊一波，文穎娟，李 蒙，李 靜，朱瑞超

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng)712046)；2.寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院(寶雞 721013)

糖尿病心肌病(Diabetic cardio myopathy，DCM)作為糖尿病并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者最主要的死亡原因[1-2]，目前西方醫(yī)學(xué)對(duì)DCM的治療，用藥體系繁雜，這可能與其眾說(shuō)紛紜的藥物治療靶點(diǎn)有關(guān)[3-6]。因此深入探討DCM治療機(jī)制便顯得尤為重要，中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有與DCM相關(guān)的記載，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其與“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等具有一定的相似性。而對(duì)于以上病癥，在中醫(yī)學(xué)中卻記載頗多，并發(fā)現(xiàn)這些病癥存在一定的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)認(rèn)為脾胃是對(duì)其進(jìn)行治療的關(guān)鍵。仝小林教授在長(zhǎng)期的臨證中對(duì)此點(diǎn)進(jìn)行了印證，認(rèn)為糖尿病的病理中心在于“胃腸”，糖尿病日久，至疾病晚期，最終由于脾胃虛憊，氣血生化乏源，而使并發(fā)癥叢生[7-8]。同時(shí)有文獻(xiàn)記載線粒體遍布人體各有氧真核細(xì)胞當(dāng)中，若其結(jié)構(gòu)、功能失常，便會(huì)導(dǎo)致人體能量代謝失常，以致影響人體五臟六腑及生命體的正常生理功能，此功能與脾相似度極高，研究發(fā)現(xiàn)線粒體的氧化磷酸化產(chǎn)能過(guò)程與脾運(yùn)化功能高度相似[9-10]。由此可見(jiàn)，DCM的發(fā)生、治療可能與線粒體質(zhì)量關(guān)系密切，這與近年來(lái)西方醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究結(jié)論不謀而合[11-12]，故認(rèn)為線粒體質(zhì)量與DCM存在一定關(guān)系，線粒體質(zhì)量直接影響了DCM的發(fā)生發(fā)展。因此本次實(shí)驗(yàn)以脾胃為中心，研究中醫(yī)組方對(duì)DCM心肌線粒體質(zhì)量的調(diào)控作用，以深入探討DCM的治療機(jī)制，并通過(guò)拆方揭示中醫(yī)治療DCM的科學(xué)內(nèi)涵。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物 葛根方：葛根10 g；葛芪方：葛根10 g、黃芪 15 g；葛參方：葛根10 g、丹參15 g；葛根與瓜蔞薤白半夏湯組成的葛蔞方：葛根10 g，薤白9 g，全瓜蔞、半夏各12 g；葛根與黃芪、丹參、瓜蔞薤白半夏湯配伍組成的葛芪參蔞方：葛根10 g，黃芪、丹參各15 g，薤白9 g，全瓜蔞、半夏各12 g。以上藥物均購(gòu)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。藥物用量參照高學(xué)敏主編《中藥學(xué)》、鄧中甲主編《方劑學(xué)》以及相關(guān)文獻(xiàn)[13]。上述中藥按常規(guī)煎法，每方每服煎取原藥液600 ml，后分別濃縮為50 ml的相應(yīng)濃縮液。對(duì)照組則選取達(dá)美康，動(dòng)物灌胃時(shí)以150 mg達(dá)美康粉末，溶于50 ml純水中，制成3 mg/ml的達(dá)美康混懸液備用。

2 主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑：鏈脲佐菌素(Streptozoto-cin,STZ )溶液(S8050)、檸檬酸鈉緩沖液(C1032)，戊二醛溶液(P1126)、羅丹明123(R8030)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(Solarbio)；812環(huán)氧樹(shù)脂包埋套裝(GP18010)、醋酸雙氧鈾(GS02624)、檸檬酸鉛染液(GZ02616)購(gòu)于北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；四氧化鋨(徠卡，GP18456)ATP Elisa試劑盒由上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇、二甲苯生產(chǎn)于成都科龍化工試劑廠；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9062)。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn)，Multlskan Mk3)由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；超薄切片機(jī)(LabX，Reichert-Jung)；透射電子顯微鏡(日本日立，H-600IV)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)碧迪公司，F(xiàn)ACSCalibur)；離心機(jī)(中佳，KDC-40)。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體重(200±20)g，均購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 造模、分組方法：新購(gòu)動(dòng)物于濕度40%～60%，溫度22oC～26oC環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，逐一稱取體重，平均(213.21±23.51)g，并隨機(jī)選取10只為空白組，剩余80只為模型組。模型組大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，選取連續(xù)兩次血糖監(jiān)測(cè)值均≥16.7 mmol/L的模型大鼠(兩次檢測(cè)時(shí)間間隔3 d)，繼續(xù)飼養(yǎng)4周形成DCM模型[14-15]。然后將成模大鼠隨機(jī)分為：模型組、達(dá)美康組、葛根組、葛芪組、葛參組、葛蔞組、葛芪參蔞組各8只。空白組選取未做造模處理大鼠8只。

4.2 給藥方法:各組大鼠均以灌胃給藥。給藥劑量參照參照施新猷主編《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》進(jìn)行換算，公式：(成人每日用藥量/60 kg)×6.25。則各組分別以其濃縮液給藥量為：達(dá)美康組16.7 mg/(kg·d)；葛根組1.04 g/(kg·d)；葛芪組2.6 g/(kg·d)；葛參組2.6 g/(kg·d)；葛蔞組4.48 g/(kg·d)；葛芪參蔞組7.6 g/(kg·d)；模型組、空白組大鼠則以生理鹽水6.5 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃。每組在給藥期間均以普通飼料喂養(yǎng)，持續(xù)9周。

5 指標(biāo)檢測(cè)

5.1 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)：各組大鼠經(jīng)藥物治療后，取大鼠心肌組織，依次經(jīng)過(guò)固定、脫水、滲透、包埋、加熱聚合、切片、染色后，通過(guò)投射電鏡觀察各組大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行比較。

5.2 心肌線粒體跨膜電位檢測(cè)：將收集好的心肌細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2次，后使用Rhodaminel 23染液進(jìn)行染色，染色后再使用PBS緩沖液清洗2次，而后以250 μl PBS重懸細(xì)胞并緩慢加入-20oC乙醇750 ml，使用流式細(xì)胞儀對(duì)其跨膜電位進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行比較。

5.3 心肌細(xì)胞ATP濃度檢測(cè)：各組大鼠經(jīng)藥物治療后，將大鼠心肌組織進(jìn)行勻漿，取上清液以免疫酶聯(lián)法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞ATP濃度進(jìn)行比較。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中計(jì)量資料采用單因素方差分析中的LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；線粒體超微結(jié)構(gòu)采用描述性分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)比較 空白組心肌肌原纖維無(wú)損傷，細(xì)胞核均勻分布于心肌組織中，線粒體結(jié)構(gòu)表達(dá)清晰，無(wú)腫脹，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體膜無(wú)損傷；模型組，部分肌原纖維溶解，心肌細(xì)胞核聚集，線粒體腫脹明顯，嵴有斷裂、溶解，部分線粒體膜損傷；經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)治療后，達(dá)美康組線粒體損傷減輕，嵴結(jié)構(gòu)清晰，但仍有部分線粒體腫脹，嵴斷裂或溶解，線粒體膜損傷，肌原纖維受損；各中藥治療組之間，葛參組、葛芪參蔞組線粒體損傷程度均低于葛根組、葛芪組、葛蔞組三組，其線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)清晰，但仍存在部分線粒體腫脹，嵴斷裂或溶解。其中以葛芪參蔞組線粒體損傷最低，且低于達(dá)美康組，表現(xiàn)為肌原纖維無(wú)明顯損傷，線粒體無(wú)明顯腫脹，嵴無(wú)明顯的斷裂或溶解，線粒體膜損傷減輕，心肌細(xì)胞核分布均勻(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)

2 各組大鼠心肌線粒體跨膜電位比較 模型組大鼠線粒體跨膜電位熒光強(qiáng)度較空白組降低，波峰左移明顯；各治療組線粒體跨膜電位熒光強(qiáng)度與空白組、模型組比較，則可通過(guò)疊加圖直觀的展現(xiàn)，各治療組波峰均在模型組、空白組之間；各治療組中，葛芪參蔞組、葛參組、葛根組三組波峰位于達(dá)美康組右側(cè)；這三組中又以葛芪參蔞組波峰最接近空白組(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌線粒體跨膜電位疊加圖

3 各組大鼠心肌細(xì)胞ATP濃度比較 見(jiàn)表1。各組較空白組，ATP濃度值顯著降低(P<0.05)；藥物干預(yù)后，達(dá)美康組、各中藥治療組ATP濃度值明顯高于模型組(P<0.05)；同時(shí)，中藥治療組中除葛芪參蔞組ATP濃度值明顯高于達(dá)美康組外(P<0.05)，其余各中藥治療組ATP濃度值與達(dá)美康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而各中藥治療組之間比較，葛芪參蔞組ATP濃度值明顯高于其余各中藥治療組(P<0.05)，其余各中藥治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞ATP濃度比較(nmol/L)

討 論

中醫(yī)認(rèn)為，DCM與“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等癥相對(duì)應(yīng)，而這些疾病之間又存在一定關(guān)聯(lián)，同時(shí)與脾胃關(guān)系密切。如《素問(wèn)·奇病論》：“脾癉……此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”。明確指出了，脾胃與消渴發(fā)病關(guān)系密切。而張仲景、巢元方在其著作中均有“消渴”與“心痛”“胸痹”相關(guān)聯(lián)的描述，如《諸病源候論》中提到：“消渴重，心中痛”。因此“消渴”兼見(jiàn)“胸痹”“胸痛”“心痛”時(shí)可以脾胃為主進(jìn)行治療，如《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》中指出：“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈”即心血充沛、心脈充盈來(lái)源于脾胃化生氣血，脾胃虛弱“四肢不用，五臟不安”，影響及心，終致“脾病不能為胃行其津液……氣日以衰，脈道不利……”癥見(jiàn)胸痹、心痛等，則為此類疾病的治療奠定了理論依據(jù)，張景岳則于《類經(jīng)·疾病》中提到：“上虛而痛者，心脾受傷也，非補(bǔ)中不可”的治療方法，可見(jiàn)中醫(yī)認(rèn)為DCM的關(guān)鍵病機(jī)是以脾氣虛弱為主而導(dǎo)致的津液代謝失常，氣血生化無(wú)源，氣無(wú)力推動(dòng)血行而成痰濁、瘀血阻滯心脈最終發(fā)生胸痹、心痛等癥。

同時(shí)近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞能量代謝異常及心肌細(xì)胞數(shù)量減少可能是導(dǎo)致糖尿病心肌病心臟功能受損的重要病理生理機(jī)制[16]。而線粒體功能障礙在糖尿病發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[17]，高血糖引起線粒體功能損傷后導(dǎo)致線粒體能量代謝異常、ROS產(chǎn)生增加、啟動(dòng)線粒體依賴性的凋亡途徑、線粒體的分裂和融合紊亂以及心磷脂含量及結(jié)構(gòu)改變，又會(huì)引起糖尿病心肌病變。而究其功能的正常實(shí)現(xiàn)，主要依賴于線粒體膜流動(dòng)性及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的正常，二者在維持線粒體功能中起著關(guān)鍵作用[18]，可見(jiàn)線粒體功能正常與否與其結(jié)構(gòu)完整息息相關(guān)。通過(guò)前文述及脾胃、線粒體、DCM之間存在一定關(guān)聯(lián)，因此我們以脾胃為中心，選定歸屬脾胃經(jīng)藥物葛根，結(jié)合中醫(yī)對(duì)DCM病機(jī)認(rèn)識(shí)，以益氣、化瘀、祛痰三法與葛根組成相關(guān)配伍，對(duì)模型大鼠心肌線粒體質(zhì)量變化進(jìn)行了觀察。

研究發(fā)現(xiàn)，DCM大鼠心肌線粒體存在一定程度的損傷，同時(shí)伴隨有膜電位降低，通過(guò)藥物干預(yù)后，損傷心肌線粒體都得到了不同程度的修復(fù)，膜電位有了不同程度的增加，心肌ATP濃度有所提升，而ATP水平的升高表明線粒體功能增強(qiáng)，能量供應(yīng)充足，動(dòng)能增加，細(xì)胞、組織運(yùn)動(dòng)能力加強(qiáng)[19]，可見(jiàn)以脾胃為中心的葛根相關(guān)配伍，能夠通過(guò)線粒體質(zhì)量的正向調(diào)控，從而達(dá)到一定的治療目的。但單味葛根及以單一治法確立的葛根配伍對(duì)受損線粒體結(jié)構(gòu)的修復(fù)、膜電位的正向調(diào)控均不及以益氣、化瘀、祛痰三法結(jié)合為組方原則的葛根配伍，可見(jiàn)益氣、化瘀、祛痰三法結(jié)合能夠更好的調(diào)節(jié)脾胃功能，使氣足、血行、邪祛，進(jìn)而產(chǎn)生一定的協(xié)同增效作用。

綜上，線粒體結(jié)構(gòu)的損傷在DCM的發(fā)生發(fā)展及治療中可能扮演著重要的角色，以脾胃為中心的葛根相關(guān)配伍可能是通過(guò)改善線粒體損傷結(jié)構(gòu)，提高其功能，調(diào)控線粒體質(zhì)量正向發(fā)展，進(jìn)而達(dá)到治療DCM的作用，這與有關(guān)研究的結(jié)果不謀而合[20]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，以化瘀為原則進(jìn)行的配伍，對(duì)線粒體質(zhì)量正向調(diào)控優(yōu)于以益氣、祛痰為原則進(jìn)行的配伍，并且益氣、化瘀、祛痰三法結(jié)合具有一定的協(xié)同增效作用，可見(jiàn)，臨床治療中，可通過(guò)以脾胃為中心，益氣、化瘀、祛痰三法結(jié)合的組方原則進(jìn)行藥物配伍治療，同時(shí)加重化瘀藥物使用比例，可能會(huì)取得更好的效果，這也可能是中醫(yī)治療DCM的科學(xué)內(nèi)涵。但是就線粒體質(zhì)量控制而言，本次研究?jī)H僅涉及到線粒體結(jié)構(gòu)、功能方面的研究，至于線粒體動(dòng)態(tài)平衡(如線粒體自噬，線粒體分裂、融合)方面沒(méi)有涉及，那么以脾胃為中心，益氣、化瘀、祛痰三法結(jié)合的組方原則進(jìn)行配伍的方劑，是否也能有效調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡，仍有待于進(jìn)一步研究。