活動(dòng)性結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞的影響因素及診斷價(jià)值

冉仁玉 李奎

陜西省安康市中心醫(yī)院感染性疾病科（陜西安康725000）

結(jié)核病是單一病因所致病死率最高的傳染 病，也是全球不容忽視的公共衛(wèi)生問題。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫功能低下是誘發(fā)結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染的高危因素之一［1］，同時(shí)慢性炎癥又會(huì)導(dǎo)致T 細(xì)胞功能障礙［2］，二者相互協(xié)同作用增加了MTB 感染及進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。為了具體了解活動(dòng)性結(jié)核（active tuber?culosis，ATB）患者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞與臨床特征的關(guān)系，本研究對(duì)確診ATB 患者的相關(guān)資料進(jìn)行了橫斷面評(píng)估，旨在識(shí)別影響ATB 患者免疫功能低下的危險(xiǎn)因素，并評(píng)估危險(xiǎn)因素的潛在診斷價(jià)值。當(dāng)缺乏CD4+T 檢測(cè)結(jié)果時(shí)，以期為臨床提供方便、快捷的評(píng)估指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析了2016年10月1日至2018年6月30日經(jīng)病原學(xué)確診的ATB 患者282 例。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（ECACH?2016012）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）痰或體液MTB?DNA/RNA 檢測(cè)陽性；（2）痰涂片抗酸桿菌染色陽性；（3）痰分枝桿菌培養(yǎng)陽性且菌種鑒定為MTB；（4）有肺部CT 掃描檢查結(jié)果；（5）外周血T 淋巴細(xì)胞亞群分析檢查結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）膽紅素≥2倍正常值上限者（2 例）；（2）HIV 抗體陽性（2 例）；（3）非結(jié)核分枝桿菌肺病者（1 例）；（4）合并肝硬化或腫瘤者（2 例）；（5）正在使用免疫抑制劑者（0 例）。

1.2 方法

1.2.1 分組及觀察內(nèi)容根據(jù)CD4+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，將患者分為免疫功能正常組（CD4+T 細(xì)胞≥404 個(gè)/μL）和免疫功能低下組（CD4+T 細(xì)胞＜404 個(gè)/μL）。收集患者的基本情況（包括性別、年齡等）、常規(guī)檢查（血常規(guī)、紅細(xì)胞沉降率等）、血清蛋白電泳（白蛋白、a1 球蛋白等）及細(xì)菌學(xué)（藥敏試驗(yàn)結(jié)果、痰菌載量）4個(gè)方面的22種變量的數(shù)據(jù)。

1.2.2 相關(guān)定義空洞定義為胸部CT 掃描肺實(shí)質(zhì)內(nèi)至少有長徑≥5 mm 的含氣透光區(qū)，周圍有大于1 mm 的浸潤灶或纖維化壁。吸煙及粉塵暴露史定義為診斷肺結(jié)核前吸煙及粉塵暴露持續(xù)時(shí)間≥3 個(gè)月。合并肺外結(jié)核指在肺以外的器官和部位發(fā)現(xiàn)結(jié)核病變。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)為隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L 或空腹血糖≥7.0 mmol/L［3］。結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)、治療史及荷菌量標(biāo)準(zhǔn)遵照《傳染性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》報(bào)告［4］。

1.2.3 變量檢測(cè)CD4+T 淋巴細(xì)胞的檢測(cè)：采用邁瑞流式細(xì)胞儀（Mindray flow cytometer BriCyte E6）檢測(cè)平臺(tái)及BD 公司的淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。樣本保存和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中處于室溫（20～25 ℃），標(biāo)本離體后48 h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在染色后24 h 內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。主要步驟如下：（1）采集空腹EDTA 抗凝靜脈血5 mL 后充分混勻血樣；（2）在試管中加入20 μL Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 試劑；（3）吸取50 μL EDTA 抗凝靜脈血分別加入試管底部（避免將血樣沾到試管壁上）；（4）試管在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫下避光孵育15 min；（5）向試管中加入450 μL 溶血素，在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫下避光孵育15 min；（6）上機(jī)自動(dòng)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0 軟件（IBM SPSS Statistics）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)為正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布以中位數(shù)M（P25，P75）表示。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)；呈正態(tài)分布的計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)，呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料的組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。缺失值采用系列均值替代。再將差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析（Forward：LR 法），對(duì)模型的擬合度進(jìn)行Hosmer?Lemeshow Test（HL 檢驗(yàn)），通過Pearson 相關(guān)系數(shù)r風(fēng)險(xiǎn)因素與CD4+T 淋巴細(xì)胞的相關(guān)程度［5］。以免疫功能正常組為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用受試者工作特征曲線（receive operating characteristic，ROC）判定獨(dú)立危險(xiǎn)因素評(píng)估免疫功能低下的診斷效能。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況在275 例患者中，男217 例（78.91%），女58 例（21.09%），年齡范圍15～84 歲，平均年齡54（38，66）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）19.23（17.53，20.96）kg/m2，平均CD4+T 淋巴細(xì)胞300.00（203.00，437.00）個(gè)/μL。免疫功能正常組80例（29.09%），平均CD4+T淋巴細(xì)胞539.00（466.25，603.50）個(gè)/mL；免疫功能低下組195 例（70.91%），平均CD4+T淋巴細(xì)胞249.00（162.00，314.00）個(gè)/mL。

2.2 CD4+T 淋巴細(xì)胞影響因素的單因素篩選結(jié)果顯示性別、吸煙史、粉塵暴露史、合并糖尿病、病程、白細(xì)胞等14 項(xiàng)指標(biāo)在兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。免疫功能低下組患者在合并肺外結(jié)核、年齡、紅細(xì)胞沉降率、a1 球蛋白顯著高于正常組（均P＜0.05），而BMI、血紅蛋白、白蛋白、β1 球蛋白顯著低于正常組（均P＜0.05），見表1、2。

2.3 CD4+T 淋巴細(xì)胞影響因素的多因素Logistic回歸分析將以上在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的8 個(gè)變量賦值后（因變量：低下組=0，正常組=1；自變量：無肺外結(jié)核=0，有肺外結(jié)核=1，其余自變量為定量變量）納入Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示，模型擬合的較好（χ2=4.520，P=0.807），預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性為71.6%；白蛋白和β1 球蛋白是免疫功能低下者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；在調(diào)整白蛋白的混雜作用后，β1 球蛋白每下降一個(gè)單位風(fēng)險(xiǎn)增加1.508 倍；調(diào)整β1 球蛋白的混雜作用后，白蛋白每下降一個(gè)單位風(fēng)險(xiǎn)增加1.094 倍，見表3。

2.4 獨(dú)立危險(xiǎn)因素與CD4+T淋巴細(xì)胞的相關(guān)性通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，白蛋白與CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈中度相關(guān)（R=0.410，P＜0.001，圖1），β1 球蛋白與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈低度相關(guān)（R=0.289，P＜0.001，圖2）。

2.5 獨(dú)立危險(xiǎn)因素診斷ATB 免疫功能低下的效能ROC 分析顯示，白蛋白和β1 球蛋白診斷免疫功能低下的效能較低，白蛋白效能優(yōu)于β1 球蛋白，見圖3及表4。白蛋白具有較高靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值、其檢測(cè)大于最佳臨界值的結(jié)果說明ATB者免疫功能低下的可能性不大，其靈敏度優(yōu)于β1球蛋白，而β1 球蛋白的特異度優(yōu)于白蛋白，見表4。

表1 275 例患者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of 275 patients 例（%）

表2 275 例患者的臨床特征Tab.2 Clinical characteristics of 275 patients M（Q25，Q75）

表3 免疫功能低下患者的Logistic 回歸分析結(jié)果Tab.3 Logistic regression analysis results of patients with low immune function

3 討論

本研究中198 例（72.0%）患者白蛋白低于正常值（< 35.0 g/L），這比BISASO 等［6］報(bào)告結(jié)核感染患者基線白蛋白降低了44.2%，這可能與本地區(qū)結(jié)核患者重癥率及就診延遲率較高有關(guān)。ATB 患者白蛋白降低的機(jī)制可能為：（1）由于胃腸功能紊亂、食欲減退導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)攝入減少，造成合成代謝降低。（2）MTB 利用機(jī)體蛋白用于自身代謝，菌體物質(zhì)引起機(jī)體反復(fù)發(fā)熱、盜汗等消耗性改變，致分解代謝增加。因此，重視白蛋白水平的變化（< 29.62 g/L）將有助于對(duì)患者免疫狀態(tài)的了解，采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施可能對(duì)疾病恢復(fù)有利。同時(shí)本研究中29.1%（80/275）患者淋巴細(xì)胞數(shù)量未見減少，這可能與T 細(xì)胞抑制受體（如程序性死亡受體1、T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白?3、淋巴細(xì)胞活化基因?3 等）表達(dá)上調(diào)，抑制了T 細(xì)胞功能發(fā)揮，導(dǎo)致免疫癱瘓有關(guān)［7］。

表4 獨(dú)立危險(xiǎn)因素評(píng)估免疫功能低下患者的效能Tab.4 Performance of independent risk factors for evaluating the patients with low immune function

圖1 白蛋白與CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性 Fig.1 The correlation between albumin and CD4+ T lymphocyte counts

圖2 β1 球蛋白與CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性 Fig.2 The correlation between CD4+T lymphocyte counts andβ1 globulin

圖3 白蛋白和β1 球蛋白評(píng)估免疫功能低下的受試者工作特征曲線Fig.3 Receiver?operating characteristics of patients with low immune function were evaluated by albumin and β1 globulin

β1 區(qū)帶球蛋白主要由轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、β脂蛋白和補(bǔ)體C4 組成。轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅素結(jié)合蛋白涉及鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存，在急性時(shí)相反應(yīng)中及營養(yǎng)不良時(shí)常隨著白蛋白同時(shí)下降。前期MINCHELLA 等［8］也發(fā)現(xiàn)低轉(zhuǎn)鐵蛋白是MTB 潛伏性感染者發(fā)展成為ATB 的危險(xiǎn)因素，本研究中β1球蛋白低于正常值下限（< 3.4 g/L）比例為35.95%（87/242），血紅蛋白下降率51.64%（142/275），這二者對(duì)CD4+T 淋巴細(xì)胞的影響均存在差異，而多因素分析結(jié)果顯示僅有β1 球蛋白是免疫功能低下的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示β1 球蛋白可能通過對(duì)機(jī)體免疫功能的影響促使結(jié)核活動(dòng)，其影響程度比血紅蛋白更大。β1 球蛋白影響機(jī)體免疫功能可能為：轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的下降，從而使進(jìn)入骨髓中的轉(zhuǎn)鐵蛋白?Fe3+減少；另一方面，MTB 感染時(shí)病原體通過合成高親和力鐵螯合物和在細(xì)胞表面表達(dá)甘油醛?3?磷酸脫氫酶受體而從宿主鐵載體蛋白中獲取鐵［9］；從而使機(jī)體鐵缺乏而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞DNA 合成抑制、CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖分化異常、巨噬細(xì)胞抗菌效應(yīng)及粒細(xì)胞的殺菌能力下降［10］。β脂蛋白隨血漿蛋白的丟失可下降，其最終變化取決于肝細(xì)胞補(bǔ)償性合成作用，具有不可預(yù)知性，而在炎癥和感染中補(bǔ)體C4 呈上升改變。本研究中β1 球蛋白水平與CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量具有低度正相關(guān)性，升高的補(bǔ)體C4 可能抵消和掩蓋了轉(zhuǎn)鐵蛋白與CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性，結(jié)核活動(dòng)與轉(zhuǎn)鐵蛋白的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。未來調(diào)節(jié)機(jī)體鐵的失衡和阻斷MTB 的鐵供應(yīng)，可能是拯救耐藥結(jié)核和提高現(xiàn)有抗結(jié)核藥物有效性的潛在策略［11］。

本研究顯示，肺外結(jié)核、年齡增加、高紅細(xì)胞沉降率和a1 球蛋白對(duì)CD4+T 淋巴細(xì)胞的影響具有意義。ALMEIDA 等［12］報(bào)告肺外結(jié)核中CD4+T 淋巴細(xì)胞呈下降改變，但與肺結(jié)核之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而筆者認(rèn)為原因可能與樣本量、檢驗(yàn)效能有關(guān)。隨著年齡的增加，T 細(xì)胞增殖下降，本研究結(jié)果與國外的研究結(jié)果［13］類似。a1 區(qū)帶球蛋白主要由a1 抗胰蛋白、a1 酸性糖蛋白、a1 脂蛋白和甲胎蛋白組成。a1 抗胰蛋白和a1 酸性糖蛋白為急性相反應(yīng)蛋白［14］，ZHANG 等［15］報(bào)道ATB 患者a1 酸性糖蛋白是血清中發(fā)現(xiàn)差異最大的蛋白峰，肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞是最重要的細(xì)胞來源［16］。本研究中78.10%（189/242）的a1 球蛋白大于正常值上限（3.5 g/L），這與近期研究結(jié)果一致［17］，在多因素分析與同樣屬于炎性反應(yīng)標(biāo)志物的紅細(xì)胞沉降率因效果不顯著而被篩選掉，其對(duì)CD4+T 淋巴細(xì)胞的影響不及β1 球蛋白。

本研究的局限性：第一，僅對(duì)影響CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的因素進(jìn)行了分析，缺乏對(duì)功能障礙的研究；第二，解釋CD4+T 淋巴細(xì)胞變異的信息量較低，其他未知因素有待進(jìn)一步探索；第三，未進(jìn)一步對(duì)β1 區(qū)帶球蛋白按不同成分進(jìn)行細(xì)化研究，未控制補(bǔ)體C4 成分的混雜影響，這可能低估了轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅素結(jié)合蛋白對(duì)免疫功能的影響；第四，納入分析的均為住院確診的ATB 患者，研究結(jié)果不一定適用于臨床診斷或疑似肺結(jié)核病例。

綜上所述，本研究報(bào)告了β1 球蛋白對(duì)ATB 患者免疫功能的影響，并進(jìn)一步得到白蛋白和β1 球蛋白評(píng)價(jià)免疫功能的最佳臨界值，這一結(jié)果對(duì)評(píng)估結(jié)核病患者的免疫狀態(tài)有一定的臨床意義。結(jié)果表明，白蛋白和β1 球蛋白水平降低是影響ATB患者免疫功能低下的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其診斷效能較低，在缺乏CD4+T 淋巴細(xì)胞檢查結(jié)果時(shí)，應(yīng)各取所長、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，其最大使用價(jià)值可能是支持性的診斷作用。