長鏈非編碼RNA?肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1對大鼠急性胰腺炎腺泡細胞增殖和凋亡的影響

衛(wèi)艷平 侯偉 崔抗

1洛陽東方醫(yī)院重癥醫(yī)學科（河南洛陽471000）；2鄭州大學（鄭州450000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由于多種因素損傷胰腺細胞，激活胰蛋白酶原等，導致胰酶消化自身胰腺及其周圍組織，引起炎癥級聯(lián)反應，嚴重者可導致全身性炎癥反應，病死率和并發(fā)癥發(fā)生率較高［1-3］。長鏈非編碼RNA（long noncod?ing RNA，LncRNA）參與調(diào)控胰腺癌細胞的增殖和侵襲過程［4］。動物實驗顯示，AP 大鼠多個LncRNA明顯失調(diào)，可作為診斷、預后和治療AP 的候選生物標志物［5］。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1（me?tastasis?associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是LncRNA 重要成員之一，參與多種腫瘤細胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。研究發(fā)現(xiàn)，LncR?MALAT1通過靶向結(jié)合miRNA 抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移［6］。LncR?MALAT1 在胰腺癌細胞中異常高表達，與預后不良有關，但其在AP 中的相關作用報道較少［7］。本研究通過建立體外AP 模型，旨在探討LncR?MALAT1 細胞增殖和凋亡的影響和相關作用機制，以期為臨床診療AP 提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠胰腺腺泡AR42J 細胞，購于中國科學院上海細胞庫。雨蛙素購自美國sigma 公司，F(xiàn)ITC/PI 凋亡試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，兔抗大鼠p53 多抗、Bax 多抗、B 淋巴細胞瘤?2基因（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）多抗、半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteme aspartate specific prote?ase?3，cleaved?caspase?3）多抗、山羊抗兔IgG?HRP購自美國Abcam 公司，雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組根據(jù)文獻［8］，建模前1 d，將AR42J 細胞接種于6 孔板，細胞貼壁后，加入雨蛙素培養(yǎng)基建立體外AP 細胞模型。AP 細胞隨機分為AP 組、NC 組、干擾組，另設為對照組。NC 組、干擾組分別轉(zhuǎn)染空載及含有LncR?MALAT1?siRNA的慢病毒載體，AP 組和對照組細胞不做處理。

1.2.2 指標檢測qRT?PCR法檢測LncR?MALAT1、miR?181a?5p mRNA 表達；MTT 法檢測細胞增殖能力；流式細胞術檢測細胞凋亡情況；Western blot法檢測p53、Bax、Bcl?2、Caspase?3 蛋白表達。預測LncR?MALAT1 與miR?181a?5p 之間的結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測LncR?MALAT1與miR?181a?5p 的靶向關系。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0 分析數(shù)據(jù)，以（±s）表示計量資料，采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK?q檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT?PCR 檢測mRNA 表達水平敲減LncR?MALAT1 后，LncR?MALAT1 mRNA 表達水平顯著降低，miR?181a?5p mRNA 表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1）。

圖1 LncR?MALAT1、miR?181a?5p mRNA 表達Fig.1 LncR?MALAT1、miR?181a?5p mRNA expression

2.2 雙熒光素酶檢測靶向性LncR?MALAT1 與miR?181a?5p 存在連續(xù)結(jié)合位點，雙熒光素酶檢測顯示LncR?MALAT1 與miR?181a?5p 可以相互結(jié)合（圖2）。

圖2 LncR?MALAT1 與miR?181a?5p 的關系Fig.2 Relationship between LncR?MALAT1 and miR?181a?5p

2.3 MTT 法檢測細胞增殖干擾組24、48、72 h 細胞活力高于AP 組、NC 組，且AP 組、NC 組、干擾組細胞活力隨著時間延長而下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，表4）。

表4 24、48、72 h 細胞活力比較Tab.4 Comparison of cell viability at 24，48，and 72 hours ±s

表4 24、48、72 h 細胞活力比較Tab.4 Comparison of cell viability at 24，48，and 72 hours ±s

注：與AP 組比較，aP < 0.05；與NC 組比較，bP < 0.05；與24 h 細胞活力比較，*P<0.05；與48 h 細胞活力比較，#P<0.05

組別AP 組NC 組干擾組F 值P 值24 h 細胞活力72.78±7.36 71.36±7.59 85.35±8.62ab 7.215 0.009 48 h 細胞活力58.08±6.02*56.68±5.74*72.84±7.81ab*9.236 0.004 72 h 細胞活力45.12±4.72*#42.63±4.61*#62.13±6.54ab*#19.576<0.001

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡對照組、AP 組、NC 組、干擾組細胞凋亡率分別為（3.02±0.32）%、（28.16±3.31）%、（30.25±3.18）%、（18.64±2.03）%。敲減LncR?MALAT1 后，細胞凋亡率顯著降低（P<0.05，圖3）。

2.5 Western blot 法檢測蛋白表達敲減LncR?MALAT1后，p53、Bax、cleaved?caspase?3表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖4、5）。

3 討論

圖3 細胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis

圖4 各蛋白表達情況Fig.4 Cell protein expression

圖5 蛋白免疫印跡圖Fig.5 Western blot

臨床診斷AP 主要依據(jù)患者臨床癥狀、血清學檢查及影像學檢查等手段，缺乏有效早期分子生物標記物或評判體系［9-10］。研究表明，凋亡在AP中可以作為一種保護機制，誘導凋亡可改善AP 嚴重程度［11］。LncRNA 與miRNA 共同調(diào)控胰腺腺泡細胞的增殖及凋亡過程，探討其在AP 中的作用機制，對于早期診斷AP 具有積極意義［12-13］。

LncR?MALAT1 在胰腺癌細胞系中差異表達，影響細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并通過調(diào)控miRNA，影響癌細胞惡性生物學行為［14-16］。miR?181a?5p 與AP 嚴重程度有關，參與介導和調(diào)控胰腺組織的修復［17-19］。本研究敲減LncR?MALAT1 表達后，miR?181a?5p 表達顯著上調(diào)，提示LncR?MALAT1 可抑制miR?181a?5p 表達，進一步發(fā)現(xiàn)LncR?MALAT1 與miR?181a?5p 3′UTR 區(qū)域特異性結(jié)合，雙熒光素酶檢測顯示LncR?MALAT1 可特異性與miR?181a?5p結(jié)合，表明LncR?MALAT1 通過靶向調(diào)節(jié)miR?181a?5p 表達影響AP 細胞增殖及凋亡。

p53 參與抑制細胞增殖、誘導凋亡等過程；p53 可促進Bax、抑制Bcl?2 表達，誘導細胞凋亡；cleaved?caspase?3 蛋白與細胞凋亡程度有關［20］。本研究敲減LncR?MALAT1 后，p53、Bax、cleaved?cas?pase?3 蛋白水平顯著降低，Bcl?2 蛋白水平顯著升高，提示敲減LncR?MALAT1 可能通過上調(diào)miR?181a?5p 表達，促進細胞增殖抑制細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR?181a?5p 可以作用于下游p53，減輕心肌凋亡，另外，還可以調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞凋亡［21-22］。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，表明敲減LncR?MALAT1 可靶向調(diào)控miR?181a?5p 表達，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。

總之，LncR?MALAT1 參與大鼠AP 細胞增殖及凋亡過程，敲減LncR?MALAT1 表達可靶向調(diào)控miR?181a?5p，促進細胞增殖，抑制凋亡，為臨床診治AP 提供新思路和新靶點。LncR?MALAT1 對AP細胞作用機制，仍待進一步研究。