氟中毒通過引起p16功能障礙抑制成骨細胞功能的機制

范淑玲 宋小東 趙玉芳

江西醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部解剖與組胚教研室（江西上饒334000）

過度消耗氟化物會損害多個器官和系統(tǒng)，尤其是骨骼和牙齒，可分別導致氟骨癥和牙質氟骨癥［1］。氟骨癥的特征是骨質改變，包括骨硬化、骨軟化或骨質疏松［2］。氟骨癥病變的發(fā)生和發(fā)展與成骨細胞的異常增殖和活化有關［3］。NaF已被證明可通過改變細胞周期進程誘導成骨細胞凋亡［4］。p16 蛋白作為負調節(jié)細胞增殖的抑制視網膜母細胞瘤（Rb）的磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶家族成員的CDK4/6，故p16 基因功能的喪失阻止細胞周期抑制。組蛋白乙酰化與基因激活相關，去乙酰化與基因抑制相關［6］。蛋白尾巴的乙?；l(fā)生在特定的位點和殘基上，通過調控RNA 聚合酶Ⅱ和轉錄因子的DNA 可達性來控制基因表達。特異性蛋白1（Sp1）是轉錄因子，激活的Sp1蛋白識別p16 啟動子中保守的Sp1?response 元件并進行調控其誘導［7-8］。組蛋白去乙酰化直接影響轉錄因子Sp1 的結合效率。本研究探究氟中毒通過引起p16 功能障礙抑制成骨細胞功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物24 周齡體質量200 g 的雄性SPF級SD 大鼠48 只購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心（實驗室合格證號為SCXK?（軍）2017?0004；飼養(yǎng)條件資質號碼：SYXK?（軍）2017?0004；動物使用的倫理審批號IACUC：2018?650?7001）。實驗分組：對照組（n=12），自來水（氟離子濃度< 0.5 mg/L）；高氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度33.00 mg/L）；中氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度16.50 mg/L）；低氟組（n=12），氟化鈉（氟離子濃度8.25 mg/L）。實驗遵循3R 原則。氟化鈉的喂養(yǎng)方式為氟化鈉溶液灌胃，喂養(yǎng)頻率為每天1次，攝入量為5 mL/次。

1.2 實驗方法

1.2.1 突觸體鈣離子濃度的測量18 個月后，當氟暴露完成后，實驗鼠頸椎脫臼處死，突觸體被分離。對突觸體鈣離子濃度進行測量測量。

1.2.2 成骨細胞活力分析采用3?（4，5?二甲基噻唑?2?yl）?2，4?二苯基四唑溴化銨（MTT）法（試劑購自上海碧云天公司）檢測NaF 對細胞增殖的影響。細胞平鋪在96 孔板中，細胞密度1×104，細胞粘附后孵育24 h。之后每孔加入20 μmol/L TT溶液（最終濃度為0.5 mg/mL），37 ℃孵育4 h；之后，棄去上清，每孔加入150 μL 二甲亞砜（DMSO）（試劑購自上海碧云天公司），充分震蕩10 min，用微平板閱讀器（試劑購自美國Thermo Electron 公司）在490 nm 處定量測定吸光度。

1.2.3 細胞周期分析流式細胞術測定細胞周期內細胞的分布。用碘化丙啶染色DNA 測定細胞周期分布。每組取約1.0×106個細胞，用2.5 mg/mL胰蛋白酶分離，用PBS 洗滌2 次，然后用70%冷乙醇在4 ℃固定4 h。然后將細胞洗兩次PBS。加入50 μg/mL 含核糖核酸酶A（50 μg/mL）的碘化丙啶溶液（試劑購自上海碧云天公司），37 ℃黑暗中孵化為30 min。使用流式細胞儀測量細胞周期各階段的細胞百分率，然后使用ModFit 軟件進行分析。增殖指數(shù)（PI）計算公式為：PI=（S + G2/M）/（S+G2/M+G0/G1）。

1.2.4 實時熒光定量PCR采用TRIzol 按標準程序提取細胞中總RNA（試劑購自上海碧云天公司）。用納米Drop2000C 測定RNA 濃度和純度后，利用逆轉錄試劑盒隨機引物逆轉錄總RNA（1 μg），按照制造商協(xié)議進行逆轉錄。在ABI PRISM 7500 序列檢測系統(tǒng)上進行。實時熒光定量PCR 采用25 ng的cDNA，定量SYBR green master mix 檢測單個基因轉錄水平。RT 反應體系（20 μL）見表1，反應條件見表2，實時熒光定量PCR，使用北京全式金生物技術公司合成下列相關引物，模板為cDNA，內參為GAPDH。對應基因引物序列見表3。

表1 cDNA 反轉錄體系Tab.1 cDNA reverse transcription system

表2 qPCR 反應條件Tab.2 qPCR reaction conditions

表3 引物的核苷酸序列Tab.3 Nucleotide sequence of primers

1.2.5 Western blot提取總蛋白，測蛋白濃度。取20 μg蛋白質電泳，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在4 ℃孵育過夜，把膜膜放入平皿中，向容器中加入5%脫脂奶粉至完全將膜覆蓋，搖床中封閉2 h；棄去脫脂奶粉溶液，取出膜置于TBST 中洗滌3次，每次5 min；加一抗（抗體anti?p16（1∶3 000）和β?actin（1∶3 000），4 ℃孵育過液，加辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗（稀釋1∶500，試劑購自美國protein intech 公司）孵育2 h 后，用增強化學發(fā)光法（購自美國Millipore 公司）檢測。用Quantity One軟件進行密度分析條帶相對密度。

1.2.6 染色質免疫沉淀分析EZ?Magna ChIP TM A/G 抗乙酰組蛋白h3（lys9）、抗乙酰組蛋白h3（lys14）、抗乙酰組蛋白h4（lys12）、抗乙酰組蛋白h4（lys16）和抗sp1 抗體試劑盒進行染色質免疫沉淀（芯片）檢測。簡單地說，用1% 甲醛處理細胞10 min，使組蛋白與DNA交聯(lián)。洗滌后的細胞顆粒懸浮在5 μL 溶解液中，在 超聲儀中進行18 次超聲處理每次9.9 s。以5 μL的上清液為輸入，在剩余的上清液中加入5 μL 的免疫沉淀抗體和20 μL 的懸浮蛋白A/G磁珠。以抗RNA聚合酶為陽性對照，以正常小鼠IgG 為陰性對照。將ChIP 反應混合物與抗體在4 ℃孵育過夜。收集蛋白A/G串珠抗體/染色質復合物，在冷緩沖液中洗滌，洗脫，然后反向交聯(lián)，用蛋白酶K 在62 ℃下消化2 h。用旋轉柱從上清液中提取純化了DNA，利用免疫沉淀法擴增p16基因的3個片段，分別由ChIP 1、ChIP 2和ChIP 3引物對輸入DNA。引物設計見表4。利用cfx96TM 實時PCR 檢測系統(tǒng)檢測SYBR 混合預混劑extaqtm ii1 擴增免疫沉淀促進基因組DNA 的差異。

表4 ChIP 1、ChIP 2、ChIP3 引物設計結果Tab.4 Primer design results of ChIP 1，ChIP 2 and ChIP 3

1.3 動物質量測量干預18個月后測量大鼠的質量，通過統(tǒng)計學分析排除因營養(yǎng)不良等因素造成的統(tǒng)計學差異。

1.4 統(tǒng)計學方法本研究采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件（美國IBM 公司）；計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗；計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氟對海馬［Ca2+］的影響所有氟處理組［Ca2+］均升高，中?氟組和高?氟組升高（P<0.05），與高?氟組于中?氟組相比出現(xiàn)下降的趨勢，見表5。

表5 氟對海馬［Ca2+］的影響Tab.5 Effect of fluoride on［Ca2 +］in hippocampus ±s

表5 氟對海馬［Ca2+］的影響Tab.5 Effect of fluoride on［Ca2 +］in hippocampus ±s

組別對照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12［Ca2+］（nmol/L）315.45±6.03 331.31±7.01 378.04±9.03 359.03±7.02 103.922<0.001

2.2 氟化物增加細胞活性，促進成骨細胞增殖隨著NaF 劑量的增加，細胞生存能力與其濃度呈依賴關系。與正常組相比，中?氟組細胞增殖能力增加（P<0.05）。隨著氟濃度的逐漸增加，高?氟組細胞增殖能力下降。見表6。

表6 骨細胞增殖能力測定結果Tab.6 Measurement results of osteocyte proliferation

2.3 流式細胞儀測定氟對成骨細胞的影響NaF可使S 期細胞數(shù)量呈劑量依賴性增加（P< 0.05），隨著NaF 濃度的升高，S 期和G2/M 期細胞比例增加，而G0/G1 期細胞比例呈劑量依賴性下降。隨著NaF 濃度的增加，PI 呈劑量依賴性增加（P<0.05）。提示NaF 可影響細胞周期從G1 期向S 期的進展，可能導致成骨細胞通過G1 期迅速進入S 期，說明NaF 對成骨細胞具有促進增殖的作用，但NaF 濃度過高（高?氟組）的細胞增殖能力出現(xiàn)下降的趨勢（P<0.05）。見表7、圖1。

圖1 流式細胞術檢測細胞周期Fig.1 Cell cycle detected by flow cytometry

表7 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細胞數(shù)量百分比Tab.7 Percentage of cells in G0/G1，s and G2/M stages ±s

表7 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細胞數(shù)量百分比Tab.7 Percentage of cells in G0/G1，s and G2/M stages ±s

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2.4 氟化物降低了成骨細胞中p16 的mRNA 和蛋白水平p16 的mRNA 水平（P< 0.05）和蛋白水平（P<0.05）呈劑量依賴性下調。見表8、9，圖2。

表8 p16 mRNA 相對表達量Tab.8 Relative expression of p16 mRNA ±s

表8 p16 mRNA 相對表達量Tab.8 Relative expression of p16 mRNA ±s

組別對照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12 p16 mRNA 相對表達量（%）0.98±0.11 0.76±0.21 0.37±0.12 0.12±0.03 102.24<0.001

圖2 Western blot 測定p16 蛋白表達量Fig.2 Western blot determination of p16 protein expression

2.5 染色質免疫沉淀分析結果與空白組相比，在高?氟化鈉治療組，H3ac、H4ac、H3K4、H4K20 的組蛋白脫乙酰作用更強（P<0.05）。見圖3。

表9 p16 蛋白相對表達量Tab.9 Relative expression of p16 protein ±s

表9 p16 蛋白相對表達量Tab.9 Relative expression of p16 protein ±s

組別對照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12 p16 蛋白相對表達量（%）0.99±0.21 0.62±0.13 0.43±0.14 0.23±0.04 104.09<0.001

2.6 動物質量測量干預18個月后大鼠的質量增加，并通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，可排除因營養(yǎng)不良等因素造成的統(tǒng)計學差異。見表10。

3 討論

氟化物是一種有益的微量元素，能維持機體健康；然而，長期過量攝入氟化物會導致慢性氟中毒。慢性氟中毒對機體的影響主要表現(xiàn)為骨骼和氟斑牙、血、肝、腎、神經系統(tǒng)損害。神經細胞鈣超載是神經系統(tǒng)疾病的重要機制之一，通過對腦缺血繼發(fā)性損傷過程的分析，得出了這一結論。鈣超載參與早期信號轉導，其中海馬神經細胞凋亡執(zhí)行階段更為重要。海馬是鈣超載引起神經損傷的重要靶器官。在本研究中，氟暴露增加了海馬CA3 區(qū)［Ca2+］。提示在慢性氟中毒作用下，鈣內流引起細胞內鈣超載，且這種增加具有一定的規(guī)律性，與氟劑量的增加有關。LIU 等［9］發(fā)現(xiàn)七氟醚組大鼠海馬神經元內的calpain［Ca2+］和76/80 kDa 在麻醉后1 d 水平升高。

表10 動物質量測量Tab.10 Animal quality measurement ±s

表10 動物質量測量Tab.10 Animal quality measurement ±s

組別對照組低-氟組中-氟組高-氟組F 值P 值例數(shù)12 12 12 12動物質量（g）256.93±9.58 260.27±10.72 256.50±12.65 266.98±10.87 6.926 0.099

然而，目前對于骨架的最佳發(fā)育和生長是否有必要還缺乏共識。氟中毒常見于發(fā)展中國家［10-11］。氟化物是一種細胞毒性物質，可誘導成骨細胞增殖和破壞細胞周期進程，導致氟骨癥的發(fā)生。本研究中，NaF 處理導致細胞活力增加，細胞周期S 期細胞積累，并以劑量依賴的方式促進成骨細胞增殖。本研究的發(fā)現(xiàn)與之前的研究結果一致［12］，進一步驗證了NaF 破壞正常細胞周期模式并誘導成骨細胞異常增殖和激活的假說。然而，細胞周期的進展受到各種調節(jié)蛋白的控制：細胞周期蛋白及其輔因子、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）。

p16 蛋白通過抑制cyclin D/CDK4 和cyclin D/CDK6 復合物磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）來控制G1 期細胞周期增殖［8］。本研究觀察到在NaF 暴露的人類初級成骨細胞中，p16 表達的轉錄抑制被組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）TSA 逆轉，這意味著p16 的抑制是由于組蛋白乙?；漠惓Ｕ{節(jié)。

以前的大多數(shù)研究都集中在接觸氟化物所引起的基因改變上［13-14］。本文研究各種表觀遺傳調控機制，以闡明氟的生物毒性，包括非編碼RNA的表達和DNA 甲基化的改變［15-16］。同時，有假說認為組蛋白乙?；揎梾⑴c了氟所致的骨科和非骨科損傷［17］。組蛋白乙?；{節(jié)基因的轉錄和表達。乙?；揎椀慕M蛋白使帶正電的賴氨酸基團帶負電荷，從而削弱組蛋白與帶負電的DNA 之間的靜電相互作用。相比之下，組蛋白去乙酰化酶可以去除乙?；菇M蛋白與DNA 相互作用更緊密，抑制基因轉錄［18］。

去乙?；淖兞巳旧|的緊密程度，壓縮了染色質的結構，使其不易被調節(jié)因子所調控［19］。許多轉錄因子通過分布在p16 啟動子區(qū)域的相應元件參與轉錄調控。許多轉錄因子通過分布在p16 啟動子區(qū)域的相應元件參與轉錄調控。本實驗結果表明，與空白組相比，在高?氟化鈉治療組，H3ac、H4ac、H3K4、H4K20 的組蛋白脫乙酰作用更強。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，暴露于不同濃度的氟后，S 期和G2/M 期的比例均上升，而TSA 可以逆轉這一趨勢。提示DNA 損傷可能參與了氟中毒的進展［20-22］。氟化鈉誘導p16 基因組蛋白脫乙酰作用，從而促進骨細胞生存能力和促進人類主要的成骨細胞增殖。綜上所述，氟中毒通過引起p16 基因乙?；种瞥晒羌毎墓δ?。